第六講 真核基因表達調(diào)控

第六講真核基因表達調(diào)控第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五真核基因表達調(diào)控的最顯著特征是能在特定時間和特定的細胞中激活特定的基因，從而實現(xiàn)“預定”的、有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化、發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內(nèi)保持正常功能。原核生物的調(diào)控系統(tǒng)就是要在一個特定的環(huán)境中為細胞創(chuàng)造高速生長的條件，或使細胞在受到損傷時，盡快得到修復，所以，原核生物基因表達的開關(guān)經(jīng)常是通過控制轉(zhuǎn)錄的起始來調(diào)節(jié)的。

第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五真核生物基因調(diào)控，根據(jù)其性質(zhì)可分為兩大類：第一類是瞬時調(diào)控或稱可逆性調(diào)控，它相當于原核細胞對環(huán)境條件變化所做出的反應，包括某種底物或激素水平升降及細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調(diào)節(jié)。

第二類是發(fā)育調(diào)控或稱不可逆調(diào)控，是真核基因調(diào)控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控（transcriptionalregulation）；

轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控（posttranscriptionalregulation）；

翻譯水平調(diào)控（translationalregulation）；

蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控（regulationofproteinmaturation）等。第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五研究基因調(diào)控主要應回答3個問題：

①什么是誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的信號？

②基因調(diào)控主要是在哪一步（模板DNA的轉(zhuǎn)錄、mRNA的成熟或蛋白質(zhì)合成）實現(xiàn)的？

③不同水平基因調(diào)控的分子機制是什么？

第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五一、真核基因組的一般構(gòu)造特點①在真核細胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。

②真核細胞DNA都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸露的。

③高等真核細胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。

④真核生物能夠有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進行DNA片段重排，還能在需要時增加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。

第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五⑤在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對較大，它們可能遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基對，這些調(diào)節(jié)區(qū)一般通過改變整個所控制基因5'上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點上可直接促進或抑RNA聚合酶與它的結(jié)合。

⑥真核生物的RNA在細胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達細胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴格的空間間隔。

⑦許多真核生物的基因只有經(jīng)過復雜的成熟和剪接過程（maturationandsplicing），才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)。

第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五二、真核基因的啟動子啟動子是一段特定的直接與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始與否的DNA序列。不同的啟動子對RNA聚合酶的親和力不同，所結(jié)合的反式作用因子（trans-actingfactors）也不同，因此，基因轉(zhuǎn)錄活性也很不相同。第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五Ⅰ.典型的原核啟動子有四大要素:

轉(zhuǎn)錄起始位點，-10區(qū)，-35區(qū)和-10區(qū)與-35區(qū)之間的間隔。原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點通常是嘌呤，其序列為CAT（A為起始位點）。

-10區(qū)是一個6堿基保守序列（常以-10為中心）。T80A95t45A60A50T96，有助于DNA的解鏈。

-35區(qū)是另一個6堿基保守序列（常以-35為中心）。T82T84G78A65C54a45

研究表明，當-10區(qū)和-35區(qū)中心位置相距16-18bp時，該啟動子的功能較強；相距較近或較遠時，起始轉(zhuǎn)錄的功能都相應減弱。

第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五Ⅱ.真核基因啟動子

真核生物有3類RNA聚合酶，負責轉(zhuǎn)錄3類不同的啟動子。

第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五由RNA聚合酶I負責轉(zhuǎn)錄的rRNA基因，啟動子（I類）比較單一，由轉(zhuǎn)錄起始位點附近的兩部分序列構(gòu)成。第一部分是核心啟動子（corepromoter），由-45—+20位核苷酸組成，單獨存在時就足以起始轉(zhuǎn)錄。另一部分由-170—-107位序列組成，稱為上游調(diào)控元件，能有效地增強轉(zhuǎn)錄效率。第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五由RNA聚合酶Ⅲ負責轉(zhuǎn)錄的是5SrRNA、tRNA和某些核內(nèi)小分子RNA（snRNA），其啟動子（Ⅲ類）組成較復雜，又可被分為三個亞類。兩類5SrRNA和tRNA基因的啟動子是內(nèi)部啟動子（internalpromoter），位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游，都由兩部分組成。第三類啟動子由三個部分組成，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游。第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五由RNA聚合酶II負責轉(zhuǎn)錄的II類基因包括所有蛋白質(zhì)編碼基因和部分snRNA基因，后者的啟動子結(jié)構(gòu)與III類基因啟動子中的第三種類型相似，編碼蛋白質(zhì)的II類基因啟動子在結(jié)構(gòu)上有共同的保守序列。

轉(zhuǎn)錄起始位點沒有廣泛的序列同源性，但第一個堿基為腺嘌呤，而兩側(cè)是嘧啶堿基。這個區(qū)域被稱為起始子（initiator，Inr），序列可表示為Py2CAPy5。Inr元件位于-3—+5。僅由Inr元件組成的啟動子是具有可被RNA聚合酶II識別的最簡單啟動子形式。多數(shù)II類啟動子有一個被稱為TATA盒的共有序列，通常處于-30區(qū)，相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的位置比較固定。TATA盒存在于所有真核生物中，TATA盒是一個保守的七堿基對，其序列為：第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五也有一些II類啟動子不含有TATA盒，這樣的啟動子稱為無TATA盒啟動子。第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五三、增強子及其對轉(zhuǎn)錄的影響

增強子是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。作為基因表達的重要調(diào)節(jié)元件，增強子通常具有下列性質(zhì)：

1、增強效應十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍。經(jīng)人巨大細胞病毒增強子增強后的珠蛋白基因表達頻率比該基因正常轉(zhuǎn)錄高600-1000倍!

2、增強效應與其位置和取向無關(guān)，不論增強子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3kp，或在基因下游，均表現(xiàn)出增強效應；

第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、大多為重復序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是產(chǎn)生增強效應時所必需的；

4、增強效應有嚴密的組織和細胞特異性，說明只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；

5、沒有基因?qū)Ｒ恍裕梢栽诓煌幕蚪M合上表現(xiàn)增強效應；

6、許多增強子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的增強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應。第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五增強子的作用原理是什么呢？一種觀點認為，增強子為轉(zhuǎn)錄因子提供進入啟動子區(qū)的位點。第二種認為，增強子能改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象。因為增強子區(qū)域容易發(fā)生從B-DNA到Z-DNA的構(gòu)象變化。第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五增強子的功能是可以累加的。SV40增強子序列可以被分為兩半，每一半序列本身作為增強子功能很弱，但合在一起，即使其中間插入一些別的序列，仍然是一個有效的增強子。因此，要使一個增強子失活必須在多個位點上造成突變。對SV40增強子而言，沒有任何單個的突變可以使其活力降低10倍。第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五四、反式作用因子對轉(zhuǎn)錄的影響真核生物啟動子和增強子是由若干可以區(qū)分的DNA序列組成的，由于它們和特定的功能基因連鎖在一起，因此稱為順式作用元件。真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控大多是通過順式作用元件和反式作用因子復雜的相互作用而實現(xiàn)的，下面介紹的是與順式作用成分專一性結(jié)合的一些轉(zhuǎn)錄因子。一般認為，如果某個蛋白是體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中起始RNA合成所必需的，它就是轉(zhuǎn)錄復合體的一部分。根據(jù)各個蛋白質(zhì)成分在轉(zhuǎn)錄中的作用，能將整個復合體分為3部分：第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五①參與所有或某些轉(zhuǎn)錄階段的RNA聚合酶亞基，不具有基因特異性。

②與轉(zhuǎn)錄的起始或終止有關(guān)的輔助因子，也不具有基因特異性。

③與特異調(diào)控序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。它們中有些被認為是轉(zhuǎn)錄復合體的一部分，因為所有或大部分基因的啟動子區(qū)含有這一特異序列，如TATA區(qū)和TFIID，更多的則是基因或啟動子特異性結(jié)合調(diào)控蛋白，它們是起始某個（類）基因轉(zhuǎn)錄所必需的。第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1．DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基序

a.Helix-turn-helix（螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋）。是最早發(fā)現(xiàn)于原核生物中的一個關(guān)鍵因子，該結(jié)構(gòu)域長約20個aa，主要是兩個α-螺旋區(qū)和將其隔開的β轉(zhuǎn)角。其中的一個被稱為識別螺旋區(qū)，因為它常常帶有數(shù)個直接與DNA序列相識別的氨基酸。

第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五b.Zincfinger（鋅指）。長約30個aa，其中4個氨基酸（Cys或2個Cys，兩個His）與一個Zinc原子相結(jié)合。與Zinc結(jié)合后鋅指結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五c.Homeodomain（同源域），最早來自控制軀體發(fā)育的基因，長約60個氨基酸，其中的DNA結(jié)合區(qū)與helix-turn-helixmotif相似，人們把該DNA序列稱為homeobox。主要與DNA大溝相結(jié)合。第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五d.Leucinezippers（亮氨酸拉鏈）

是親脂性（amphipathic）的α螺旋，包含有許多集中在螺旋一邊的疏水氨基酸，兩條多肽鏈以此形成二聚體。每隔6個殘基出現(xiàn)一個亮氨酸。由賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）組成DNA結(jié)合區(qū)。第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五e.堿性螺旋--環(huán)--螺旋（basichelix-loop-helix）

該調(diào)控區(qū)長約50個aa殘基，同時具有DNA結(jié)合和形成蛋白質(zhì)二聚體的功能，其主要特點是可形成兩個親脂性α-螺旋，兩個螺旋之間由環(huán)狀結(jié)構(gòu)相連，其DNA結(jié)合功能是由一個較短的富堿性氨基酸區(qū)所決定的。第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2.DNA結(jié)合蛋白主要轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域

轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptionactivationdomains）一般由20-100個氨基酸殘基組成。如GAL4分子中有2個這種結(jié)構(gòu)域，分別位于多肽鏈的第147-196位和第768-881位；GCN4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于多肽鏈的第106-125位。a.酸性α-螺旋(acidicα-helix)

該結(jié)構(gòu)域含有由酸性氨基酸殘基組成的保守序列，多呈帶負電荷的親脂性α-螺旋，包含這種結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子有GAL4、GCN4、糖皮質(zhì)激素受體和AP-1/Jun等。增加激活區(qū)的負電荷數(shù)能提高激活轉(zhuǎn)錄的水平。可能是通過非特異性的相互作用與轉(zhuǎn)錄起始復合物上的TFIID等因子結(jié)合生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復合物而促進轉(zhuǎn)錄。第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五b.谷氨酰胺豐富區(qū)(glutamine-richdomain)

SP1的N末端含有2個主要的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，氨基酸組成中有25%的谷氨酰胺，很少有帶電荷的氨基酸殘基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳動物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有這種結(jié)構(gòu)域。C.脯氨酸豐富區(qū)(proline-richdomain)

CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端與其轉(zhuǎn)錄激活功能有關(guān)，含有20%-30%的脯氨酸殘基。第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3.與已知DNA序列相結(jié)合的反式作用因子

a.CAAT盒激活因子

CTF（CAATboxtranscriptionfactor）家族是能識別CAAT盒的一組轉(zhuǎn)錄因子。這一組因子是由單個基因通過可變換的剪接而形成的一組mRNA產(chǎn)生的。CTF家族成員對各種CAAT盒有相同的親和力。另一組CAAT區(qū)結(jié)合蛋白被稱為CP，它們是從人的HeLa細胞中得到的。CP1具有對α-球蛋白和腺病毒晚期基因啟動子CAAT區(qū)的高親和力，CP2具有對γ-血纖蛋白原基因啟動子CAAT區(qū)的高親和力，而CP3能與腺病毒DNA相結(jié)合。CP族蛋白主要以異源多聚體的形式存在。第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五除了CTF和CP族蛋白能與CAAT區(qū)結(jié)合外，科學家還從小鼠肝細胞里發(fā)現(xiàn)兩個CAAT區(qū)結(jié)合蛋白。CBP對序列GCAAT有較強的親和力，而ACF則對卵清蛋白基因啟動子區(qū)的CCAAT有高親和力。因此，在啟動區(qū)發(fā)現(xiàn)某個保守序列，并不等于同一個蛋白因子參與了該基因的調(diào)控。對9個哺乳動物類β-球蛋白基因和1個人α-球蛋白基因5'調(diào)控區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎每個基因都具有CCAAT（-80位左右）區(qū)和TATA（-30左右）區(qū)。

第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五b.TATA區(qū)結(jié)合蛋白RNA聚合酶II需要與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，才能順利起始轉(zhuǎn)錄。通常把輔助因子需要量最小的啟動子稱為一般性啟動子（genericpromoter），具有組成型表達特性，這些啟動子上游調(diào)控區(qū)及所需轉(zhuǎn)錄因子在絕大多數(shù)甚至全部基因中都是高度保守的。第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五TBP結(jié)合于DNA的小溝。TBP與DNA的結(jié)合在體外實驗中保護了大約一圈雙螺旋DNA免受核酸酶的降解，其覆蓋的位置處于-37～-25。TAFs的加入延伸了對DNA的覆蓋，整個TFIID復合物可覆蓋-45～-10區(qū)域。第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五C.GC區(qū)結(jié)合因子

GC區(qū)結(jié)合蛋白SP1是1.0x105的單體，能與DNA鏈上包括GGGCGG在內(nèi)約20bp的序列特異結(jié)合。在SV40啟動子區(qū)，從-70～-110的6個GC區(qū)全部與SP1結(jié)合，所以這個區(qū)域的DNA不會被降解。在胸腺嘧啶激酶啟動子區(qū)，SP1既與上游的CTF（CAAT區(qū)結(jié)合蛋白）相互作用，又與下游的TFIID緊密相關(guān)。

GC區(qū)對SP1的結(jié)合是必需的，但該序列對于SP1親和力卻很不相同，證明GC區(qū)兩翼序列同樣在SP1的識別及結(jié)合過程中發(fā)揮作用。人們推測GC區(qū)、尤其是多次重復的GC區(qū)，與基因的永久型表達有關(guān)。第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五d.八堿基對元件激活蛋白

八堿基對元件也能被多個激活蛋白識別。Oct-1是非淋巴樣細胞中結(jié)合八堿基對元件的轉(zhuǎn)錄激活因子，沒有組織特異性。Oct-2則是組織特異的激活因子。

一般說來，一個特定的共有序列元件能被相應的轉(zhuǎn)錄因子或一個轉(zhuǎn)錄因子家族的成員所識別，而相同的元件也能被不同的轉(zhuǎn)錄因子所識別。第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五五、真核基因轉(zhuǎn)錄后加工的多樣性1．簡單轉(zhuǎn)錄單位

第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2.復雜轉(zhuǎn)錄單位

含有復雜轉(zhuǎn)錄單位的主要是一些編碼組織和發(fā)育特異性蛋白質(zhì)的基因，它們除了含有數(shù)量不等的內(nèi)含子以外，其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能通過多種不同方式加工成兩個或兩個以上的mRNA。第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五利用多個加poly（A）位點和不同的剪接方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。這類基因5'末端雖只有一個轉(zhuǎn)錄起始位點，但有兩個或多個加poly（A）位點，因此可通過不同的剪接方式得到不同的蛋白質(zhì)。第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3.mRNA穩(wěn)定性控制

真核生物能否長時間、及時地利用成熟的mRNA分子翻譯出蛋白質(zhì)以供生長、發(fā)育的需要，是和mRNA的穩(wěn)定性以及屏蔽狀態(tài)的解除相關(guān)的。

原核生物mRNA的半衰期很短，平均大約3min。高等真核生物迅速生長的細胞中mRNA的半衰期平均3h。在高度分化的終端細胞中許多mRNA極其穩(wěn)定，有的壽命長達數(shù)天。第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)運鐵蛋白受體（TfR）和鐵蛋白負責鐵吸收和鐵解毒。這兩個mRNA上存在相似的順式作用元件，稱為鐵應答元件（ironresponseelement，IRE）。IRE與IRE結(jié)合蛋白（IREBP）相互作用控制了這兩個mRNA的翻譯效率。當細胞缺鐵時，IREBP與IRE具有高親和力，兩者的結(jié)合有效地阻止了鐵蛋白mRNA的翻譯，與此同時，TfRmRNA上3'非翻譯區(qū)中的IRE也與IREBP特異結(jié)合，有效地阻止了TfRmRNA的降解，促進TfR蛋白的合成。第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五4.蛋白質(zhì)因子的修飾與翻譯起始調(diào)控

用兔網(wǎng)織紅細胞粗抽提液研究蛋白質(zhì)合成時發(fā)現(xiàn)，如果不向這一體系中添加氯高鐵血紅素，網(wǎng)織紅細胞粗抽提液中的蛋白質(zhì)合成抑制劑就被活化，蛋白質(zhì)合成活性在幾分鐘之內(nèi)急劇下降，很快就徹底消失。現(xiàn)已查明，網(wǎng)織紅細胞蛋白質(zhì)合成的抑制劑HCI是受氯高鐵血紅素調(diào)節(jié)的eIF-2的激酶，可以使該因子的α-亞基磷酸化并由活性型轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚孕汀５谖迨?，共七十頁，編輯?023年，星期五六、真核基因表達調(diào)控舉例

現(xiàn)代分子生物學上把能與某個（類）專一蛋白因子結(jié)合，從而控制基因特異表達的DNA上游序列稱為應答元件（responseelement）。它們與細胞內(nèi)高度專一的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。最常見的應答元件有：

熱激應答元件（heatshockresponseelement，HSE），

糖皮質(zhì)應答元件（glucocorticoidresponseelement，GRE），

金屬應答元件（metalresponseelement，MRE）第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五七、真核基因表達研究方法與應用

1、基因敲除技術(shù)(GeneK