第四組液相色譜法測定對位紅

第四組液相色譜法測定對位紅第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五

目前對于食品中的對位紅測定方法主要采用薄層色譜法·“液相色譜分析法”列和液相色譜／質(zhì)譜分析法等，其中法定檢測方法包括歐盟委員會(huì)規(guī)定的辣椒粉中蘇丹紅測定的高效液相色譜法測定和我國質(zhì)檢總局頒布的《食品中蘇丹紅染料的檢測方法——高效液相色譜法》(GB／T19681—2005)，但這兩類標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中存在一定的技術(shù)缺陷，如樣品本底干擾定性結(jié)論、固體萃取柱的活性難于控制、均未涉及對“對位紅”的檢測方法建立、對檢測的干擾等。本方案針對標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施過程中可能出現(xiàn)的復(fù)雜問題，探討了在提取、分析方面的條件優(yōu)化，使液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀能滿足日常的檢測工作的需要。第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五一、對位紅的簡介對位紅亦稱對硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點(diǎn)248-252℃。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于機(jī)油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。對位紅的熔點(diǎn)即已達(dá)到250℃，明顯不能采用氣相色譜法來進(jìn)行檢驗(yàn)，因?yàn)闃悠泛茈y汽化。所以我們采用液相色譜法來對其進(jìn)行檢測。第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五物化性質(zhì)1、物理性質(zhì)：對位紅亦稱對硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點(diǎn)248-252℃。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于機(jī)油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。2.化學(xué)性質(zhì)它和引發(fā)英國有史以來最大一起食品召回行動(dòng)的“蘇丹紅”染料相似，都是工業(yè)上使用的化學(xué)物質(zhì)，都被禁止在食品染色劑中使用。據(jù)牛津大學(xué)物理與理論化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)品安全信息介紹，“對位紅”對眼睛、皮膚和呼吸系統(tǒng)有刺激性，但其毒性尚在研究中，沒有明確的結(jié)論。第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五二、對位紅檢測及標(biāo)準(zhǔn)檢測方法一、液相色譜法1.高效液相色譜法2.凝膠凈化液相色譜法3.反相高效液相色潽法二、分光光度法--紫外可見分光光度計(jì)第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五二、檢測方法1、1高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)室操作方案儀器：天美液相色譜儀、超聲清洗器、無油真空泵及溶劑過濾裝置、濾膜過濾器、平頭微量進(jìn)樣器試劑：乙腈（色譜純）、冰醋酸。色譜條件：色譜柱選用C18柱（柱長15cm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20L；樣品運(yùn)行時(shí)間：15min；VWD波長選用485nm，作為對位紅的檢測波長；流動(dòng)相為乙腈:水/90:10，不需要緩沖第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五

步驟：（1）取乙腈400ml，用0.45um的有機(jī)濾膜過濾后置于原瓶。取16ml冰醋酸溶于100ml蒸餾水中，用0.45um的水相濾膜過濾后置于乙腈瓶中，貼上標(biāo)簽。超聲波清洗器脫氣15min。將配置好的流動(dòng)相置于色譜儀旁的籃筐內(nèi)，放入流動(dòng)相吸液管。（2）準(zhǔn)確稱取1-（4-硝基苯基偶氮）-2-萘酚10mg，用經(jīng)過濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，濃度為100ug/ml。分別吸取該儲備液0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ml置于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即配成對位紅濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五（3）準(zhǔn)確稱取對位紅樣品10.0mg，用經(jīng)過濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，從中取1ml再用乙腈稀釋至100ml。（4）打開液相色譜儀電源開關(guān)，開高壓輸液泵開關(guān)。設(shè)定流動(dòng)相A通道流量為100%，設(shè)流動(dòng)相流速為1ml/min。（5）啟動(dòng)泵開關(guān)，打開紫外檢測器電源開關(guān)。設(shè)定檢測波長為480nm（6）打開液相色譜工作站，選擇通道。（7）觀察基線狀態(tài)，當(dāng)基線走直后，即可進(jìn)樣。（8）開始進(jìn)樣：平頭微量注射器用乙腈清洗5次，廢液排到濾紙上。將進(jìn)樣閥柄置于“l(fā)oad”位置。第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五（9）在注射器中吸入標(biāo)樣或試樣60ul，注入進(jìn)樣口，重復(fù)3次，此時(shí)對定量管進(jìn)行了清洗。（10）吸入標(biāo)樣60ul。將標(biāo)樣注入進(jìn)樣口，順時(shí)針旋動(dòng)進(jìn)樣閥至“inject”位置。此時(shí)工作站開始自動(dòng)計(jì)時(shí)。（11）數(shù)據(jù)采集：從計(jì)算機(jī)顯示屏上可以看到樣品的流出過程和分離狀況，待所有的色譜峰流出完畢后，按“stop“鍵停止分析。記錄保留時(shí)間及色譜峰面積。（12）結(jié)束工作：所有樣品分析完畢后，讓流動(dòng)相繼續(xù)流動(dòng)10~20min。關(guān)閉色譜工作站、關(guān)閉檢測器電源、關(guān)閉液相色譜儀電源開關(guān)。第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五數(shù)據(jù)處理：（1）繪制工作曲線：以對位紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線（2）從曲線上直接查的未知試樣對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)處理：保留時(shí)間：4.521峰高：210123峰面積：221456第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五1.2凝膠凈化液相色譜法優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，填充完凝膠柱后可重復(fù)使用，實(shí)際用量少于歐盟及國標(biāo)方法，并且用淋洗液替代劇毒而又昂貴的乙腈進(jìn)行提取，自制凝膠柱凈化富集避免了歐盟方法用乙腈直接萃取進(jìn)樣對色譜柱壽命的影響及雜質(zhì)峰的干擾，也避免了國標(biāo)方法中采用氧化鋁柱凈化活度難以控制的麻煩，一次進(jìn)樣可同時(shí)檢測食品中對位紅、蘇丹紅的含量應(yīng)用范圍：食品及調(diào)味品中對位紅、蘇丹紅的檢測儀器及試劑：Agilent1100高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器)層析柱<1.6cm×50cm,填充Bio2BeadsS2X3凝膠。蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及對位紅標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于95%,配制時(shí)用少量三氯甲烷溶解,乙腈定容為0.5000g·L-1儲備液(按實(shí)際含量折算),使用時(shí)用乙腈稀釋至所需濃度。第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五色譜條件色譜柱ZorbaxSB2C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)+酸性水溶液(用乙酸調(diào)至約pH4.0);洗脫程序:0～9minA90%;9～12min;A線性變化到100%,保持5min后回到初始比例;流速1.0mL·min-1;柱溫35℃;進(jìn)樣量20μL;二極管陳列檢測器,程序可變波長見表1。第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五1.3反相高效液相色潽法簡介：在推薦參考方法的基礎(chǔ)上,對分離和色譜條件加以改進(jìn)、優(yōu)化、選擇,用于幾種含對位紅食品采用擬定的方案進(jìn)行分離檢測。結(jié)果:方法的檢出限為011μg/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(r)019999,在014-116μg/ml添加水平間,加標(biāo)的回收率95%～105%,RSD019%～911%。改進(jìn)的方法準(zhǔn)確可靠,檢測效率高,具有實(shí)際應(yīng)用意義。應(yīng)用：測定食品中對位紅的殘留量第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五儀器、試劑及色譜條件儀器設(shè)備Waters2695型高效液相色譜儀。Waters、996型二極管陣列紫外檢測器。MilliQplus型超純水器,美國Millipore公司產(chǎn)品。超聲波清洗器。試劑對位紅標(biāo)準(zhǔn)品(95%,AcrosOrganics,USA);乙腈(分析純和色譜純)。色譜條件色譜柱,MERCKLichrocart250-4Lichrospher100RP-18,4×250mm,5μm;流動(dòng)相:水+乙腈(5+95);流速:110ml/min;檢測波長:485nm;進(jìn)樣量:10μl。第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五2.1.分光光度法--紫外可見分光光度計(jì)應(yīng)用范圍：1.檢定物質(zhì)

根據(jù)吸收光譜圖上的一些特征吸收，特別是最大吸收波長雖ax和摩爾吸收系數(shù)是檢定物質(zhì)的常用物理參數(shù)。這在藥物分析上就有著很廣泛的應(yīng)用。在國內(nèi)外的藥典中，已將眾多的藥物紫外吸收光譜的最大吸收波長和吸收系數(shù)載入其中，為藥物分析提供了很好的手段。2.與標(biāo)準(zhǔn)物及標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照

將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)完全一致。如果沒有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照進(jìn)行比較。這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測定條件要相同。3.比較最大吸收波長吸收系數(shù)的一致性4.純度檢驗(yàn)

5.推測化合物的分子結(jié)構(gòu)

6.氫鍵強(qiáng)度的測定

實(shí)驗(yàn)證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強(qiáng)度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強(qiáng)度，以確定選擇哪一種溶劑。7.絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定8.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究9.在有機(jī)分析中的應(yīng)用

第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五簡介

在分光光度計(jì)中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí)，便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強(qiáng)度。如以波長（λ）為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法。第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五三、對位紅檢測方案的確定結(jié)論：選用高效液相色譜法理由：①對位紅的熔點(diǎn)為248-252度，很難汽化，明顯不能用氣相色譜法來進(jìn)行檢測。②以高效液相色譜法的檢測為基礎(chǔ)的方法成本相對較低，且應(yīng)用廣泛。③根據(jù)學(xué)校實(shí)驗(yàn)室器材選擇的要求可知，選用高效液相色譜法滿足要求。第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期五測定所需儀器：UV7504型紫外可見分光光度計(jì)，比色皿，材料與試劑：對位紅標(biāo)準(zhǔn)品，乙醇，對位紅樣品。操作步驟