細(xì)胞工程第四章細(xì)胞培養(yǎng)詳解演示文稿

細(xì)胞工程第四章細(xì)胞培養(yǎng)詳解演示文稿本文檔共81頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\22點26分1（優(yōu)選）細(xì)胞工程第四章細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共81頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\22點26分24.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征本文檔共81頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\22點26分34.1.1體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型1.貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞2.懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。本文檔共81頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\22點26分4細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。

上皮細(xì)胞型：乳腺癌細(xì)胞本文檔共81頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\22點26分5胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞型：本文檔共81頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\22點26分6游走細(xì)胞型：

呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。本文檔共81頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\22點26分7多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

本文檔共81頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\22點26分8本文檔共81頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\22點26分9見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。

2.懸浮型概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)本文檔共81頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\22點26分104.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點1.貼附貼附并伸展是貼壁細(xì)胞體外培養(yǎng)時的基本生長特點。本文檔共81頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\22點26分11

體外培養(yǎng)的小鼠子宮上皮細(xì)胞(a)消化分離得到的細(xì)胞團塊；(b)生長至第3天的細(xì)胞單層；(c)生長至第4天的細(xì)胞單層；(d)生長至第6天的細(xì)胞單層本文檔共81頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\22點26分124.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點2.接觸抑制

接觸抑制是體外培養(yǎng)中某些貼附型細(xì)胞生長特性之一。一般情況下，正常細(xì)胞不停頓的活動或移動，其外周的細(xì)胞膜呈現(xiàn)一些特征性皺褶樣活動。但是，當(dāng)兩個細(xì)胞由于移動而相互靠近發(fā)生接觸時，細(xì)胞不再移動，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜皺褶樣活動停止，從而使細(xì)胞停止運動。這種由細(xì)胞接觸而抑制細(xì)胞運動的現(xiàn)象稱為接觸抑制。

本文檔共81頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\22點26分134.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點2.接觸抑制

由于細(xì)胞之間有接觸抑制生長特性，一般正常生長細(xì)胞并不互相重疊于其上而生長，而是呈單層生長。但是腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制而能夠繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴展，使細(xì)胞發(fā)生堆積。因此，（接觸抑制）可作為區(qū)分正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。本文檔共81頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\22點26分144.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點3.密度抑制

細(xì)胞接觸匯合后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進行增殖分裂，數(shù)量仍然增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。本文檔共81頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\22點26分154.1.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程

細(xì)胞系的生長過程分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。本文檔共81頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\22點26分16

細(xì)胞系的生長過程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期為新鮮組織自體內(nèi)取出并在體外培養(yǎng)生長至第一次傳代的時期。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長一定時間之后，如貼附型細(xì)胞即融合成片而逐漸鋪滿底物的表面，此時，便應(yīng)將原代細(xì)胞分開接種至2個或更多的新的培養(yǎng)器皿中，即傳代，此即成細(xì)胞系。一般有限細(xì)胞系在此期的細(xì)胞開始時雖仍然存活，但增殖已很緩慢并逐漸完全停止，進而細(xì)胞發(fā)生衰退死亡。本文檔共81頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\22點26分17每代細(xì)胞的生長過程所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。本文檔共81頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\22點26分183.組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：

潛伏期（LatentPhase）;指數(shù)生長期（LogarithmicgrowthPhase）;停止期/平臺期（StagnatePhase）.本文檔共81頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\22點26分19理想的實驗用細(xì)胞本文檔共81頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\22點26分204.1.5體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化本文檔共81頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\22點26分21(1)主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

可能出現(xiàn)脫分化或去分化細(xì)胞趨向單一化；4.1.5體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化本文檔共81頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期日\22點26分22（2）與體內(nèi)主要不同點

相對孤立、相對單一

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響

(3)

提示

要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細(xì)胞

是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。

本文檔共81頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期日\22點26分234.2細(xì)胞培養(yǎng)液本文檔共81頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期日\22點26分24細(xì)胞的常用液體本文檔共81頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期日\22點26分25水：新鮮配置的三蒸水或超純水2.平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。常用的緩沖液：生理鹽水、PBS、PBS(注意有無鈣鎂離子)、Hank’s液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）配液時注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級純(特級純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘。（5）貯存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時混合和稀釋，過濾除菌備用。本文檔共81頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期日\22點26分263膠原酶0.25%本文檔共81頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期日\22點26分274.pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過程中或超過要求值時，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存。本文檔共81頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期日\22點26分285抗生素溶液(PS)為防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg。配制時取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mlHanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/ml，鏈霉素1×104μg/ml，使用時每100ml培養(yǎng)液中加入0.5-1ml。本文檔共81頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期日\22點26分296.本文檔共81頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期日\22點26分307.本文檔共81頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期日\22點26分31細(xì)胞培養(yǎng)基本文檔共81頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期日\22點26分32營養(yǎng)需要基本營養(yǎng)物質(zhì)：包括氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無機離子。促生長因子：體外培養(yǎng)細(xì)胞既需要上述基本營養(yǎng)物質(zhì)，還需要促細(xì)胞生長因子等物質(zhì)才能正常生長、繁殖。血清中含有多種這類物質(zhì)，有利于多數(shù)細(xì)胞的存活和生長。RPMI-1640培養(yǎng)液10~20%FBS本文檔共81頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期日\22點26分33細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。本文檔共81頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期日\22點26分341.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。

本文檔共81頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期日\22點26分35合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。

缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。本文檔共81頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期日\22點26分36基本培養(yǎng)基的種類P252附表4MEMDMEMIMDMRPMI1640M199、M109HamF12McCoy’5A本文檔共81頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期日\22點26分37本文檔共81頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期日\22點26分38本文檔共81頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期日\22點26分394.2.2培養(yǎng)基的配制（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制仔細(xì)閱讀說明書配制要保證充分溶解配制所用水應(yīng)為超純水本文檔共81頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期日\22點26分40

合成培養(yǎng)基（粉）1袋碳酸氫鈉2.0g

青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml

過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制本文檔共81頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期日\22點26分41基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％（2）完全培養(yǎng)基－有血清培養(yǎng)基的配制本文檔共81頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期日\22點26分42人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；

②多種金屬離子；

③激素；各種生長因子；

④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；

⑤胰酶抑制因子；

⑥轉(zhuǎn)移蛋白；

⑦不明成分。血清本文檔共81頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期日\22點26分43一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清。對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。血清的作用本文檔共81頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期日\22點26分44血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘。血清的消毒：過濾除菌。血清的使用本文檔共81頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期日\22點26分452.培養(yǎng)基的配制（3）無血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋添加成分本文檔共81頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期日\22點26分46無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。F12＋DMEM＋添加成分（ECM、營養(yǎng)成分、生長因子、酶的抑制劑、結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白）（3）無血清（無酚紅）培養(yǎng)基配制2.培養(yǎng)基的配制本文檔共81頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期日\22點26分474.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)本文檔共81頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期日\22點26分48

4.3.1.原代細(xì)胞培養(yǎng)

是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。

最接近和反應(yīng)體內(nèi)生長特性本文檔共81頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期日\22點26分491.組織取材2.組織細(xì)胞分離機械法消化法3.培養(yǎng)方法（1）組織塊（2）單層細(xì)胞培養(yǎng)（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共81頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期日\22點26分50組織塊培養(yǎng)法本文檔共81頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期日\22點26分51Step1將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰新潔爾滅浸泡消毒，迅速進入無菌室。

實驗1成年小鼠腎臟細(xì)胞原代培養(yǎng)（組織塊培養(yǎng)法）本文檔共81頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期日\22點26分52Step2

將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔本文檔共81頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期日\22點26分53Step3用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪，本文檔共81頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期日\22點26分54Step4剪碎組織本文檔共81頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期日\22點26分55Step5接種組織塊本文檔共81頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期日\22點26分56移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。本文檔共81頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期日\22點26分57觀察24～48小時后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細(xì)胞生長不好，則培養(yǎng)液pH過高；若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細(xì)胞生長良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時見細(xì)胞自組織邊緣長出。繼續(xù)培養(yǎng)3～5日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁時便可進行傳代培養(yǎng)。本文檔共81頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期日\22點26分58請觀看視頻教程！

新生乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)本文檔共81頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期日\22點26分594.3.2傳代培養(yǎng)

細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代或者再培養(yǎng)。在體外傳代的細(xì)胞生長一代包括3個過程：潛伏期、生長對數(shù)期、平臺期。傳代培養(yǎng)分為：原代培養(yǎng)后第一次傳代和常規(guī)傳代本文檔共81頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期日\22點26分601.第一次傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代細(xì)胞生長到一定階段時，可以進行第一次傳代。從原代培養(yǎng)到第一次傳代的時間取決于原代培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)細(xì)胞的活性、細(xì)胞類型和特點、接種的細(xì)胞密度、培養(yǎng)條件等。本文檔共81頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期日\22點26分612.常規(guī)傳代培養(yǎng)

（1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞傳代（2）貼壁細(xì)胞的消化法傳代本文檔共81頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期日\22點26分62消化傳代的步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟（2）貼壁細(xì)胞的消化法傳代本文檔共81頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期日\22點26分63用胰蛋白酶消化傳代abcdef本文檔共81頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期日\22點26分64貼壁細(xì)胞的消化法傳代應(yīng)注意：1)適時傳代2)不同細(xì)胞的傳代要區(qū)別對待3)消化液濃度要適宜4）次傳代的細(xì)胞接種數(shù)量可適當(dāng)多一些本文檔共81頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期日\22點26分654.5細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運輸本文檔共81頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期日\22點26分66細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。本文檔共81頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期日\22點26分67

凍存當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。應(yīng)用低溫保護劑和改進凍融方法本文檔共81頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期日\22點26分68低溫保護劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。本文檔共81頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期日\22點26分69細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。1年后，存活率可達(dá)80％-90％。DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。本文檔共81頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期日\22點26分70

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。本文檔共81頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期日\22點26分71慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡易程序

將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。本文檔共81頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期日\22點26分72細(xì)胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛