丙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)

丙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)目的：保證HCVDNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。適用范圍：HCVDNA的TaqMan熒光定量檢測(cè)，標(biāo)本類型為血清。負(fù)責(zé)人：操作人：原理：本試劑盒用一對(duì)丙型肝炎病毒特異引物和一條丙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以逆轉(zhuǎn)錄液，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)丙型肝炎病毒cDNA。性能參數(shù)：檢出低值＜1×103基因拷貝/ml。標(biāo)本要求：（1）標(biāo)本類型：血清。（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊(cè)。（3）標(biāo)本儲(chǔ)存和運(yùn)輸：室溫放置不超過(guò)2小時(shí)，4-8℃不超過(guò)72小時(shí)，-20℃保存期6個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融，室溫運(yùn)輸。（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能作測(cè)定。容器和添加劑類型：無(wú)菌離心管和無(wú)菌真空管。所需設(shè)備：ABIGeneAmp5700、臺(tái)式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外燈。試劑：DNA提取液（500μl/管）2管；HCV-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽(yáng)性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1×108基因拷貝/ml）（50μl/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μl/管）1管。校準(zhǔn)程序（計(jì)量學(xué)溯源性）：程序步驟:：11.1標(biāo)本采集和運(yùn)送用無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血1ml，注入無(wú)菌1.5ml離心管,于室溫靜置2小時(shí),轉(zhuǎn)至4℃靜置1小時(shí)。8000rpm離心5分鐘，吸取200ul血清(注意勿帶入紅細(xì)胞)轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌1.5ml離心管，即為血清標(biāo)本。標(biāo)本可立即用于測(cè)試（48小時(shí)以內(nèi)），也可保存于-20℃待測(cè)，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。11.2標(biāo)本及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的處理向一新的經(jīng)高壓滅菌處理過(guò)的0.5ml離心管中加入10ul充分混勻的RNA提取液(RNA提取液A易沉淀,取樣前需用移液器反復(fù)吸打混勻后吸取)。加入50ul血清或陰陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，再加入200ul的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘，6000rpm，離心1分鐘，小心吸去上清，用75%的預(yù)冷乙醇（DEPC水配制）洗沉淀兩次。（取75%乙醇400ul洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75%的乙醇400ul重復(fù)同上處理），65℃干燥沉淀10分鐘。（注：75%的乙醇配制時(shí)須用試劑盒中提供的DEPCH2O）。11.3逆轉(zhuǎn)錄向沉淀管加入18ulHCV反應(yīng)液I以及逆轉(zhuǎn)錄酶系2ul，震蕩均勻，瞬間（3秒）離心后37℃放置45分鐘，95℃加熱3分鐘。瞬間（3秒）離心后，吸取5ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR反應(yīng)。11.4PCR擴(kuò)增及DA-620儀器熒光檢測(cè)操作取單管單人份PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul，6000rpm離心數(shù)秒。將各后應(yīng)管放入PCR儀器的孔反應(yīng)槽內(nèi)，在電腦上按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)類和循環(huán)條件：ABIGeneAmp5700的循環(huán)條件：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃45秒55℃60秒，先做10個(gè)循環(huán)，最后93℃30秒55℃45秒，做30個(gè)循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。11.5結(jié)果分析條件的設(shè)定ABIGeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值(2~4),stop值(7~9)以及Threshold值,使陰性質(zhì)控品Ct值為30,臨界陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為22~24,強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為18~20,最后記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的Ct值.12.質(zhì)量控制程序：13.干擾（如乳糜血、溶血、膽紅素血）和交叉反應(yīng)：乳糜血、溶血、膽紅素血基本不影響本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。14.生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml。15.患者檢驗(yàn)結(jié)果的可報(bào)告區(qū)間：Ct值<40，實(shí)驗(yàn)樣本的HCVDNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品HCVDNA含量<1×103基因拷貝/ml。16