小結抗體制備的實驗方法

小結抗體制備的實驗方法

1材料與方法

材料金銀花新鮮花蕾于20XX年4～5月采自山東臨沂,憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥研究所。經李圣波鑒定后樣品保存于80℃冰箱中,備用。

2基因克隆

依據(jù)金銀花LjPAL1基因編碼區(qū)序列,利用軟件Primer-Premier5設計引物:;利用金銀花反轉錄一鏈cDNA作為模板進行PcR反應,用于全長cDNA的擴增。PcR反應體系為:,模板1μL,引物應程序:94℃預變性5min,然后進行30個循環(huán),循環(huán)結束后72℃10min,4℃保溫。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PcR產物,利用SanPrep柱式PcR產物純化試劑盒回收目標PcR產物,并將其與pmD19-T載體連接,轉化DH5α感受態(tài)細胞,在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選,選擇陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。將鑒定正確的質粒命名為pmD19-PAL1,并利用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒。

3原核表達載體構建

分別將pmD19-PAL1、pET-32a載體質粒用SalⅠ37℃酶切2h后,NotⅠ繼續(xù)酶切2h,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物,利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒分別回收、左右的目的條帶。將兩片段在T4Ligase連接體系中,于16℃連接過夜。連接產物轉化α感受態(tài)細胞,并利用PcR進行陽性克隆鑒定,引物序列、PcR體系和程序同上。挑選陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。所構建的原核表達載體,包含完整的LjPAL1的基因編碼區(qū),重組質粒命名為pET32-PAL1。將構建好的重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞,并利用PcR進行陽性克隆鑒定,引物序列、PcR體系和程序同上。挑選陽性克隆北京六合華大基因公司測序。

4抗體制備

首先使用的是Geneious軟件進行二級結構和親疏水性的預測,著重選擇有β-轉角、無規(guī)則蜷曲、親水的肽段;再使用SwISS-moDEL/)預測三級結構,著重選擇暴露在蛋白表面的肽段;根據(jù)以上信息綜合分析選擇最佳肽段作為候選抗原位點,并合成多肽抗原,制備多克隆抗體。取200μg免疫原,用生理鹽水稀釋到200～500μL,再加入等體積弗氏佐劑,初次免疫用弗氏完全佐劑,加強免疫用弗氏不完全佐劑;用混勻儀器將溶液和佐劑混勻,形成油包水。將混勻好的免疫原在左右的新西蘭大白兔背部皮下注射免疫,打8～10個點。每隔12天加強免疫一次,每次免疫量為200μg蛋白。第3次免疫后10～15天采血,采用Protein-G親和純化相應的多抗血清,獲得誘導6h后的大腸桿菌細胞總蛋白經SDS電泳后,于20V恒壓下轉移至硝酸纖維素膜,時間約為40min。用5%脫脂奶粉封閉1h后按1∶20XX稀釋比例加入一抗,60r·min1振蕩反應1h,經PBST洗滌后按1∶8000稀釋比例加入二抗,60r·min1振蕩反應1h。用化學發(fā)光顯色試劑盒顯色,采用UVP化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察顯色結果。7酶聯(lián)免疫吸附分析利用間接ELISA方法進行LjPAL1蛋白含量分析。取含有pET32-PAL1質粒的大腸桿菌誘導表達,菌液超聲破碎后分別利用PBS緩沖液,溶于1L蒸餾水中,pH7.稀釋倍作為抗原,以PBS作為對照。包被PBS稀釋菌液,一抗為稀釋100