DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的形成及發(fā)展

PCR的實(shí)現(xiàn)1985PE-CetusMullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間

DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理模擬細(xì)胞內(nèi)DNA合成的過(guò)程利用了DNA變性、復(fù)性和能進(jìn)行雜交的特點(diǎn)通過(guò)全自動(dòng)的熱循環(huán)儀來(lái)完成DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqDNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR反應(yīng)的基本條件

模板的制備模板是進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增的依據(jù)，它的來(lái)源于不同的材料。PCR對(duì)模板的質(zhì)量要求很高，但對(duì)它量的要求不高。制備模板的材料：新鮮材料：人或動(dòng)物的血液及組織中提??；從少量材料：痰、尿液、腹腔液等;

法醫(yī)學(xué)的材料：血斑、精斑等；考古材料從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。提取的原理和方法：（略）DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)⑤引物-3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR所用試劑：

DNA聚合酶

buffer:包括兩種，一種是含Mg++，一種是不含Mg++

。

dNTPsDNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的操作過(guò)程設(shè)定一個(gè)加樣配方：標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液5ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA～2ug

TaqDNA聚合酶

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至50ulDNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)加樣：

單樣本加樣多樣本加樣加樣的順序PCR反應(yīng)條件的設(shè)定：

預(yù)就性溫度：94℃，30秒變性溫度：94℃，30秒退火溫度：需要摸條件延伸溫度：72℃，30秒總延伸溫度：72℃，10分DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR結(jié)果的鑒定通過(guò)凝膠電泳的方式來(lái)進(jìn)行。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR的初衷是為特異性的擴(kuò)增某段DNA現(xiàn)在PCR在醫(yī)學(xué)研究中主要是用于基因診斷，常用于：對(duì)遺傳病的突變基因進(jìn)行診斷對(duì)病原體的基因診斷通過(guò)PCR結(jié)合限制酶切的診斷

SSCP技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的診斷RT-PCR進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增及定量表達(dá)熒光定量PCR技術(shù)

DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核酸的凝膠電泳一、基本原理1.核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場(chǎng)，它們會(huì)向正電極的方向遷移。

2.在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量大的DNA遷移速度慢。當(dāng)分子量相同時(shí)，超螺旋的DNA分子因其密度大，遷移速度快，松弛型開環(huán)DNA遷移速度慢于前者，而線性DNA的速度最慢。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

3．電泳環(huán)境的影響：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移速度。

當(dāng)電泳緩沖液中無(wú)離子時(shí)，溶液導(dǎo)電性極小，電泳速度慢。當(dāng)電泳緩沖液中離子濃度極強(qiáng)時(shí)，則導(dǎo)電性極高，并易產(chǎn)熱。pH值也影響遷移率，溶液的pH遠(yuǎn)離樣品的等電點(diǎn)時(shí)，樣品顆粒的電離程度大，相應(yīng)的電泳速率就大。凝膠材料的不同，以及濃度的不同對(duì)同樣大小顆粒的電泳速率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。

DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及結(jié)構(gòu)分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖50000-10000.7%瓊脂糖20000-10001.4%瓊脂糖6000-3004.0%聚丙烯酰胺1000-10010.0%聚丙烯酰胺500-25 20.0%聚丙烯酰50-1DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)凝膠的作用DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)4．凝膠電泳的目的：

可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進(jìn)行分離，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子量maker鑒定其大小。對(duì)所要的目的分子進(jìn)行純化提取。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)二、瓊脂糖凝膠電泳AgaroseGelElectrophoresis瓊脂糖是從海藻中提取出的長(zhǎng)鏈狀多聚糖，當(dāng)它被加熱到90℃時(shí)可被溶解成半透明的液體，這時(shí)便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點(diǎn)這40-45℃。瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)：操作方便，并可用來(lái)鑒定和純化特定的DNA分子。DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)AgaroseGelElectrophoresis-+3DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisSybergoldDetectionLimit:~0.2-0.5ngDNAEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA(Notinhandout)DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA的聚合以及酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用低溶點(diǎn)瓊脂糖來(lái)分離并純化DNA。瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在之間，對(duì)一些分辨更小DNA分子的實(shí)驗(yàn)將無(wú)法進(jìn)行。瓊脂糖電泳結(jié)果的顯示：

1.利用核酸與溴化乙錠吸附性強(qiáng)的特點(diǎn)，用溴化乙錠來(lái)顯色。

DNA的聚合