蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備演示文稿

蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備演示文稿本文檔共50頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\16點50分優(yōu)選蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備本文檔共50頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的電泳分離電泳分離的原理:

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),在一定的pH下,可以解離為帶電荷的離子。在電場中可以電泳移動。電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的快慢，用電泳遷移率(M)表示：

M為遷移率；dL為顆粒移動的距離；L為通電的時間。E為兩個電極之間的電勢差。M=EtdL本文檔共50頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\16點50分影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。本文檔共50頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\16點50分影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。本文檔共50頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\16點50分影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。本文檔共50頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\16點50分緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。離子強度增強，緩沖液所載的分電流隨之增加，樣品所載分電流降低，樣品電泳速度變慢離子強度太低，電導(dǎo)率太小，樣品移動緩慢本文檔共50頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\16點50分影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。本文檔共50頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\16點50分電泳的類型自由界面電泳使用支持物的區(qū)帶電泳。

區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。本文檔共50頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\16點50分聚丙烯凝膠電泳SDS凝膠等電聚焦本文檔共50頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\16點50分SDS電泳在蛋白質(zhì)中加入摩爾比為1.4：1(SDS:蛋白質(zhì))的SDS(十二烷基硫酸鈉)。使所有蛋白質(zhì)都帶上負電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基形式。在上樣緩沖液中加入巰基乙醇，可以使二硫鍵還原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋白質(zhì)的電荷與形狀，只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。本文檔共50頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\16點50分SDS電泳當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logM=K-bX

M為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。本文檔共50頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\16點50分SDS電泳繪制標準曲線：

按下式計算相對遷移率：

以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。本文檔共50頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\16點50分SDS電泳PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中,由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。本文檔共50頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\16點50分不連續(xù)SDS各部分凝膠配制電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當(dāng)進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。本文檔共50頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\16點50分Figure6.2.4SDSresultsoffractionS1(SRA)兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白

MW=66,200兔肌動蛋白

MW=43,000牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制劑

MW=20,100雞蛋清溶菌酶

MW=14,400本文檔共50頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\16點50分SDS應(yīng)注意的幾個問題制備凝膠時，TEMED要加膠之前再加。電泳之前蛋白質(zhì)要溶解在含1%的SDS和1%的巰基乙醇的磷酸緩沖液(0.01mol/L,pH7.2),1000C加熱2~5分鐘。如凝膠中含有雜質(zhì)，可以在加入樣品前先預(yù)電泳0.5~1小時。SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，解離為亞單位，電泳結(jié)果顯示的只是亞單位的大小，同時蛋白質(zhì)也會失去原來的活性。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。本文檔共50頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\16點50分等電聚焦電泳

蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。本文檔共50頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\16點50分等電聚焦電泳根據(jù)要分離的蛋白質(zhì)的pI的不同，訂購不同pH梯度的凝膠，可以對蛋白質(zhì)樣品進行分離。

如3.5~9.5、2.5~6.0、5.0~8.5、7.5~10等。凝膠的pH值范圍越窄，分辨力越高?？煞蛛x等電點相差0.01個pH單位的蛋白質(zhì)，最高可以分辨0.0025個pH單位的蛋白質(zhì)。等電凝膠可以抵消擴散作用，蛋白質(zhì)可以富集在很窄的區(qū)帶上。適用于少量蛋白質(zhì)樣品的分析鑒定，不適用于大量制備。要求用無鹽的溶液，而蛋白質(zhì)在無鹽溶液中容易沉淀；在等電點發(fā)生沉淀和變性的蛋白質(zhì)也不適合用次方法分離。本文檔共50頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\16點50分pI的測定可以用染色法觀察蛋白質(zhì)，然后用表面電極直接測量pH值?；?qū)⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝膠塊并且測量pH。本文檔共50頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\16點50分雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。1975年，O’Farrell首先運用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。本文檔共50頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\16點50分本文檔共50頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\16點50分PAGE電泳分離的大分子的檢測考馬斯亮藍染色法

可檢出0.3~1ug的蛋白質(zhì)。銀染色法銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價絡(luò)鹽的形式結(jié)合，用甲醛將銀離子還原為可見的銀顆粒?？蓹z測ng水平的蛋白質(zhì)。熒光染色技術(shù)熒光合成物質(zhì)與PAGE上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出強烈的熒光，可檢測到PAGE中的蛋白質(zhì)。本文檔共50頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期六\16點50分免疫印跡法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。具體操作為經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。本文檔共50頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期六\16點50分免疫印跡法抗原包被的實驗?zāi)l

特異性人抗體標記的二抗標記本文檔共50頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期六\16點50分免疫印跡法本文檔共50頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的結(jié)晶本文檔共50頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的結(jié)晶可以作為蛋白質(zhì)提純的方法之一。蛋白質(zhì)純度達到一定值時可以結(jié)晶。通過反復(fù)重結(jié)晶可以除去其中的雜質(zhì)，使蛋白質(zhì)得到更大程度的純化。蛋白質(zhì)結(jié)晶體是比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，所以結(jié)晶可以作為一個穩(wěn)定的儲存的方法。在蛋白質(zhì)結(jié)晶之后，可以提供作X射線衍射分析用的材料，來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等數(shù)據(jù)。本文檔共50頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)結(jié)晶的原理蛋白質(zhì)溶液在合適的過飽和狀態(tài)，溶質(zhì)分子通過擴散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運動形式，可以形成晶核。溶質(zhì)分子以相互碰撞的作用方式有序而反復(fù)地堆砌在晶核上，直到晶核成長到晶體，最后從溶液中析出。本文檔共50頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期六\16點50分晶體結(jié)晶的條件蛋白質(zhì)純度越高，結(jié)晶越容易，至少要在50%以上。蛋白質(zhì)濃度。濃度越高，結(jié)晶機會越大。但過大會因雜質(zhì)存在而導(dǎo)致晶形不好。一般結(jié)晶的蛋白質(zhì)濃度在10~50mg/mL。溫度。蛋白質(zhì)結(jié)晶溫度在0~400C。一般在40C冷室或250C溫箱中進行。pH。一般在蛋白質(zhì)的等電點的pH附近結(jié)晶。金屬離子和離子強度。一些二價離子可以引起或有利于蛋白質(zhì)的結(jié)晶過程。沉淀劑。沉淀劑(如鹽類和各種有機溶劑)可改變蛋白質(zhì)的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇(PEG)和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。本文檔共50頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)結(jié)晶方法鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入鹽，使蛋白質(zhì)溶解度降低，之后以結(jié)晶形式從溶液中析出。有機溶劑法有機溶劑可以使蛋白質(zhì)介電常數(shù)降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)晶析出。等電點結(jié)晶。蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，可以形成結(jié)晶。脫鹽結(jié)晶。一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶于鹽溶液的蛋白質(zhì)結(jié)晶而出，然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對溫度敏感的蛋白質(zhì)，不同溫度溶解度變化大?？蛇\用此法。金屬離子。在某些蛋白質(zhì)溶液中加入金屬離子，可以促進晶體的形成。本文檔共50頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)提純過程中的定量本文檔共50頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的定量(1)定氮法測量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量（克%）

=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25本文檔共50頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的定量(2)雙縮脲法第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。

雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為0.1g/mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.01g/mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵,因此,含兩個或亮個以上的肽鍵化合物尤其是蛋白質(zhì)都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。本文檔共50頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期六\16點50分雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)物可在540nm處進行比色測定可以測定蛋白質(zhì)的含量，可測定范圍為0.1~1.0mg/mL。

！此反應(yīng)為肽及蛋白質(zhì)特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應(yīng)。本文檔共50頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期六\16點50分蛋白質(zhì)的定量(3)福林-酚試劑法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍色化