高通量測序技術及其在農(nóng)業(yè)上的應用

一、高通量測序簡介二、高通量測序平臺的介紹三、高通量測序技術在農(nóng)業(yè)上的應用本文檔共28頁；當前第1頁；編輯于星期六\18點53分1.1什么是高通量測序技術高通量序技術（next-generationsequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量的測序技術，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

一.高通量測序技術本文檔共28頁；當前第2頁；編輯于星期六\18點53分1.2為什么要發(fā)展高通量測序技術快速和準確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學研究一直具有十分重要的意義。對于每個生物體來說，基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術能夠真實地反映基因組DNA上的遺傳信息，進而比較全面地揭示基因組的復雜性和多樣性，因而在生命科學研究中扮演了十分重要的角色。本文檔共28頁；當前第3頁；編輯于星期六\18點53分1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術的誕生。盡管第一代測序技術已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的第二代測序技術誕生了。本文檔共28頁；當前第4頁；編輯于星期六\18點53分1.3高通量測序技術的特點速度快準確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大本文檔共28頁；當前第5頁；編輯于星期六\18點53分二

高通量測序技術的原理高通量測序技術包括Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術。下面對三種高通量測序技術的原理和特點分別進行具體介紹。本文檔共28頁；當前第6頁；編輯于星期六\18點53分454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測序：A磁珠制備設備B454測序儀C454測序原理本文檔共28頁；當前第7頁；編輯于星期六\18點53分本文檔共28頁；當前第8頁；編輯于星期六\18點53分本文檔共28頁；當前第9頁；編輯于星期六\18點53分454測序流程與BaseCalling每次加入一種堿基然后再對熒光強度進行讀取。堿基聚合反應產(chǎn)生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光，熒光強度和焦磷酸的量成正比。本文檔共28頁；當前第10頁；編輯于星期六\18點53分454技術的主要缺點是無法準確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應中會一次加上多個T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結果不準確。也正是因為這個原因，454技術主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。454技術最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。本文檔共28頁；當前第11頁；編輯于星期六\18點53分IlluminaSolexa簡介橋式PCR邊合成邊測序可逆終止物HiSeq2000本文檔共28頁；當前第12頁；編輯于星期六\18點53分本文檔共28頁；當前第13頁；編輯于星期六\18點53分本文檔共28頁；當前第14頁；編輯于星期六\18點53分Solexa的特點與主要應用讀長較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應用：RNA測序、表觀遺傳學研究本文檔共28頁；當前第15頁；編輯于星期六\18點53分ABISOLiD簡介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團進行檢測SOLiD5500xl本文檔共28頁；當前第16頁；編輯于星期六\18點53分ABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉到測序玻片本文檔共28頁；當前第17頁；編輯于星期六\18點53分ABISOLiD測序原理測序流程依次加入五種引物進行五次測序。加入測序引物及加入oligo連接酶連接，激發(fā)熒光檢測，循環(huán)一個流程，換一種引物再循環(huán)一個流程，五個流程結果疊加分析出序列。本文檔共28頁；當前第18頁；編輯于星期六\18點53分SOLiD的特點與主要應用讀長較短，50-75bp精度高，可達Q40通量高，20-30G每天，1Run可達120G主要應用：基因組重測序、SNP檢測等本文檔共28頁；當前第19頁；編輯于星期六\18點53分三種平臺的技術差異本文檔共28頁；當前第20頁；編輯于星期六\18點53分三、高通量測序技術在農(nóng)業(yè)上的應用目前，高通量測序技術已廣泛應用于動植物全基因組測序、基因組重測序、轉錄組測序、小RNAs測序和表觀基因組測序等方面。下面對高通量測序技術在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應作以介紹。本文檔共28頁；當前第21頁；編輯于星期六\18點53分3.1全基因組重測序全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎上對個體或群體進行差異性分析。全基因組重測序的個體，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、插入缺失位點(InDel，Insertion/Deletion)、結構變異位點(SV，StructureVariation)，通過生物信息學手段，分析不同個體基因組間的結構差異，同時完成注釋。

本文檔共28頁；當前第22頁；編輯于星期六\18點53分3.1.1利用重測序進行進化分析及SNP篩選

Lai等(2010)對6個玉米(Zeamays)骨干自交系進行了全基因組重測序，共發(fā)現(xiàn)

1273124個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)，得到30178個1～6bp的插入缺失位點(InDels)，新發(fā)現(xiàn)的這些SNPs和InDels提供了1個高密度的全基因組標記信息，同時也鑒定出數(shù)百個基因獲得與丟失變異(Presence/AbsenceVariations，PAVs)。本文檔共28頁；當前第23頁；編輯于星期六\18點53分3.1.2利用重測序技術鑒定突變體突變基因Ashelford等(2011)對一個擬南芥突變體ebi－1的回交系進行基因組重測序，隨后又通過對突變體的表達數(shù)據(jù)進行調查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小，最終成功鑒定出1個在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突變表型的SNPs位點該研究證實利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音，對其進行測序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。本文檔共28頁；當前第24頁；編輯于星期六\18點53分3.2全基因組denovo測序

全基因組denovo測序也稱為從頭測序，是直接對某個物種進行基因組全測序，然后利用生物信息學方法對序列進行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列、基因組測序對研究物種的基因組和功能基因信息、闡明物種的進化及其生長發(fā)育具有重要的意義。

Huang等(2009)完成的黃瓜(CucumissativusL.)全基因組測序是世界上第一個完成全基因組測序的蔬菜作物，該工作的完成對黃瓜及其他近緣物種的遺傳、改良基礎生物學研究等具有重要的意義。本文檔共28頁；當前第25頁；編輯于星期六\18點53分3.3轉錄組測序研究

轉錄組是指特定組織或細胞在某一功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非

編碼RNA。轉錄組測序是指通過新一代高通量測序技術對cDNA測序，利用統(tǒng)計相關reads數(shù)計算出不同mRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)轉錄水平的SNP新的mRNA等，該技術可以從表達水平、等位基因特異性表達RNA編輯、含有重要信息的融合基因轉錄子差異剪接等方面展開相關研究。本文檔共28頁；當前第26頁；編輯于星期六\18點53分Zhang等(2010)用8種不同水稻(OryzasativaL.)樣品的不同組織于不同時期混合建庫，通過轉錄組技術分析了栽培稻的第1張轉錄組圖譜，結果在水稻8種組織樣品中檢測到大約27000個基因的表達和38000個轉錄單元，證實了約9000個基因發(fā)生可變剪接，同時鑒定出