檳榔提取物體外抗柯薩奇病毒B3及單純皰疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究

檳榔提取物體外抗柯薩奇病毒B3及單純皰疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究【摘要】目的從檳榔9種提取物中體外篩選出抗柯薩奇病毒B3，單純皰疹病毒1型活性成分，從其中3種提取物中體外篩選出抗乙型肝炎病毒的活性成分。方法通過觀察藥物毒性、病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)、MTT法，判斷藥物毒性及藥物抗病毒效應(yīng)。結(jié)果檳榔9種提取物對(duì)Hela,Vero細(xì)胞具有一定的毒性，而無抗病毒活性，3種提取物不能有效地抑制細(xì)胞HBeAg的表達(dá)。結(jié)論檳榔9種提取物體外無抗柯薩奇病毒B3、單純皰疹病毒1型的作用，3種提取物體外無抗乙型肝炎病毒的作用。

【關(guān)鍵詞】檳榔；柯薩奇病毒；單純皰疹病毒1型；乙型肝炎病毒

Abstract:ObjectiveToscreennineextractsofArecacatechuL.foranti-CoxackievirusB3,HSV-1andthreeextractsofArecacatechuL.foranti-HBVintoxicandantiviraleffectwasevaluatedbyobservingtoxiceffect,cytopathiceffect(CPE),MTTcolorimetricassayforvitalcellextractshadcertaintoxiceffectsonHelaandVerocellsinvitro,buttheyhadnoantiviralactivities.ThreeextractsofArecacatechuL.couldnotinhibittheexpressionofcell‘sHBeAg.ConclusionNineextractsofArecacatechuL.havenoeffectofanti-CoxackievirusB3，HSV-1andthreeextractsofArecacatechuL.havenoanti-HBVinvitro.

Keywords:ArecacatechuL.;CoxsackievirusB3(CVB3);HSV-1;HBV

檳榔為棕櫚科植物，臨床常用其干燥成熟種子。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證明,檳榔具有健胃消食、行氣利水、殺蟲瀉下、利濕除疸的功效［1］。本實(shí)驗(yàn)以柯薩奇病毒B3感染Hela細(xì)胞，單純皰疹病毒1型感染Vero細(xì)胞和細(xì)胞，以檳榔的鮮花、果實(shí)、花苞不同部位的9種提取物體外抗柯薩奇病毒B3、單純皰疹病毒1型和其中花苞的3種提取物體外抗乙型肝炎病毒進(jìn)行了研究。

1材料與儀器1藥物檳榔9種提取物由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供。植物樣品，粉碎，醋酸乙酯提取，甲醇提取，熱水提取，依次得到醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物。醋酸乙酯提取物、甲醇提取物用二甲基亞砜溶解1mg/ml，水提物用水溶解高壓滅菌1mg/ml。2細(xì)胞Hela細(xì)胞株、Vero細(xì)胞株引自美國(guó)ATCC。細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10%新生小牛血清的DMEM,細(xì)胞維持液為含2%新生牛血清的DMEM,常規(guī)加入青霉素100U·ml-1，鏈霉素100U·ml-1。細(xì)胞HBVDNA經(jīng)克隆轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞系,由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒研究所提供。3病毒柯薩奇B3病毒(CVB3)由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒研究所提供。病毒在HepG-2細(xì)胞中活化增殖后,其滴度為10-9TCID50·ml-1,實(shí)驗(yàn)用100TCID50·ml-1。單純皰疹病毒1型由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒研究所提供。病毒在Vero細(xì)胞中活化增殖后,其滴度為10-9TCID50·ml-1,實(shí)驗(yàn)用100TCID50·ml-1。4試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司);病毒唑(利巴韋林注射液,Ribavirininjection廣州市市橋藥業(yè)有限公司);無環(huán)鳥苷(ACV)購于湖北科益藥業(yè)股份有限公司;CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司);相差顯微鏡(德國(guó)Laica公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。MTT為Sigma公司產(chǎn)品。

2方法

抗CVB3實(shí)驗(yàn)

藥物毒性實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上加入×105/ml濃度的Hela細(xì)胞，100μl/孔，培養(yǎng)24h，待其生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，將檳榔9種不同提取物用維持液配制成不同濃度的藥液，加入到細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、陽性對(duì)照組，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48h，其間置倒置顯微鏡下觀察，觀察藥物的最大無毒濃度。

藥物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上加入×105/ml濃度的Hela細(xì)胞，100μl/孔，培養(yǎng)24h，待其生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，不同稀釋度的藥物和病毒各50μl混合后直接加到單層Hela細(xì)胞上，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24～36h，其間置倒置顯微鏡下觀察CPE。待病毒對(duì)照組的細(xì)胞病變達(dá)到75%及以上時(shí)，觀察并記錄各樣品各濃度的細(xì)胞病變情況，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性。

抗HSV-1實(shí)驗(yàn)

藥物毒性實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上加入×105/ml濃度的Vero細(xì)胞，100μl/孔，培養(yǎng)24h，待其生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，將檳榔9種不同提取物用維持液配成的不同的濃度，加入到細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、陽性對(duì)照組，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48h，其間置倒置顯微鏡下觀察，觀察藥物的最大無毒濃度。

藥物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板上加入×105/ml濃度的Vero細(xì)胞，100μl/孔,待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后棄生長(zhǎng)液,棄去培養(yǎng)液，不同稀釋度的藥物和病毒各50μl混合后直接加到單層Vero細(xì)胞上，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、陽性對(duì)照組，置5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變的情況。待病毒對(duì)照組的細(xì)胞病變達(dá)到75%及以上時(shí)，觀察并記錄各樣品各濃度的細(xì)胞病變情況，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性。

抗乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性檢測(cè)將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后，配制成2×105/ml細(xì)胞懸液，加入96孔板中，培養(yǎng)24h，待其生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，將檳榔3種不同提取物用維持液配成的不同的濃度，加入到細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48h，其間置倒置顯微鏡下觀察，觀察藥物的最大無毒濃度。

HBeAg的檢測(cè)采用Abott試劑進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析。將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后，配制成2×105/ml細(xì)胞懸液，加入96孔板種，培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，再加入用維持液配成的各種濃度的藥液，檳榔的濃度為200，100，50μg/ml。每?jī)商鞊Q含同濃度藥物的培養(yǎng)液1次,同時(shí)收集上清液后進(jìn)行檢測(cè)，共收集3次。

3結(jié)果

細(xì)胞毒性測(cè)定

Hela細(xì)胞的毒性結(jié)果見表1。藥物的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹,增殖緩慢,胞質(zhì)顆粒增多,折光性差,邊界模糊、破碎,但未見脫落壞死。由表1可以看出檳榔的鮮花和花苞對(duì)Hela細(xì)胞的毒性比果實(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的毒性要小。

表1檳榔提取物對(duì)Hela細(xì)胞的毒性結(jié)果

Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見表2。由表2可以看出檳榔對(duì)Vero細(xì)胞的毒性均很小。

細(xì)胞的毒性結(jié)果3種提取物的最大無毒濃度均是200μg/ml。

抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檳榔9種提取物抗柯薩奇病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果CVB3病毒對(duì)照組在Hela細(xì)胞上引起的細(xì)胞病變發(fā)展迅速,24～36h后細(xì)胞固縮,變圓,破裂,很快脫落。而藥物組各濃度的細(xì)胞形態(tài)的變化與病毒對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)變化一致。

檳榔9種提取物抗單純皰疹病毒1型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果HSV-1病毒對(duì)照組在Vero細(xì)胞上引起的細(xì)胞病變也迅速，36～48h后細(xì)胞被病毒侵噬，拉成網(wǎng)狀。而藥物組各濃度的細(xì)胞形態(tài)的變化與病毒對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)變化一致。

檳榔花苞3種不同提取物對(duì)細(xì)胞株HBeAg表達(dá)的抑制作用見表3。檳榔花苞3種不同提取物作用細(xì)胞后，其HBeAg表達(dá)量與正常細(xì)胞中HBeAg表達(dá)量沒有差異。

表2檳榔提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果

表3藥物作用36h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg的測(cè)定結(jié)果

SML-P2-HB-E1，SML-P2-HB-E2，SML-P2-HB-E3為檳榔花苞3種不同提取物

4討論

柯薩奇病毒是小RNA病毒科的腸道病毒屬，可引起人類嚴(yán)重的胰腺炎和心肌炎，也是心肌衰竭和擴(kuò)張性心肌病的重要原因。其中以柯薩奇B3最為多見，它屬典型的溶細(xì)胞病毒。單純皰疹病毒1型是DNA病毒，屬于皰疹病毒a亞科，是最早發(fā)現(xiàn)的人類皰疹病毒，也是最常見的病毒。它能引起許多疾病，包括急性皰疹口腔炎、唇皰疹、角膜結(jié)膜炎、甲溝炎、皮膚皰疹性損害、生殖器皰疹、皰疹性腦炎等炎癥性疾?。?］。目前臨床上對(duì)這兩種病毒的治療最有效的藥物分別是病毒唑和核苷類藥物，但這些藥的副作用都很多。因此開發(fā)出新的抗病毒藥物成為研究病毒藥物的熱點(diǎn)。而我國(guó)是一個(gè)中藥資源很豐富的國(guó)家，本課題的研究目的就是從已經(jīng)證明有抗病毒活性的南藥中篩選出具有抗病毒的活性成分。

檳榔在臨床上主要是驅(qū)殺腸道寄生蟲，對(duì)皮膚真菌、流感病毒、幽門螺旋桿菌均有抑制作用；檳榔的主要化學(xué)成分是檳榔堿，檳榔堿具有擬膽堿的作用，能興奮膽堿受體，促進(jìn)唾液、汗腺分泌，增加腸蠕動(dòng)，減慢心率，降低血壓，滴眼可使瞳孔縮小。有臨床資料顯示檳榔和別的中藥一起使用可以用于治療急性病毒性肝炎的不同時(shí)期［3］，而在本實(shí)驗(yàn)中檳榔不能有效的抑制細(xì)胞HBeAg的表達(dá)，這可能與藥物之間的配伍有關(guān)，也有可能與調(diào)節(jié)免疫有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究了檳榔9種提取物體外抗柯薩奇病毒、單純皰疹病毒1型的實(shí)驗(yàn)和其中3種提取物體外抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這9種提取物體外無抗柯薩奇病毒、單純皰疹病毒1型的作用，且其中3種提取物體外無抗乙型肝炎病毒的作用。

【參考文獻(xiàn)】

［1］梁寧霞檳榔藥理作用研究進(jìn)展［J］.江蘇中醫(yī)藥，2004，2