酵母雙雜交(自激活)

酵母雙雜交(自激活)第一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五真核生物的轉(zhuǎn)錄因子是由兩個(gè)可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。一、原理酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。第二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五

GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)結(jié)合。

AD則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活功能。第三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五第四頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五His,β-gal第六頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五一般情況下，單獨(dú)的BD可以與GAL4上游活化序列（GALUAS）結(jié)合，但不能引起轉(zhuǎn)錄。然而，將一段具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建到BD載體上，若其表達(dá)產(chǎn)生的BD單獨(dú)與UAS結(jié)合也可以引起下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，那么就稱之為酵母雙雜中的自激活現(xiàn)象。反過來，可以利用這種自激活現(xiàn)象來驗(yàn)證某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。第七頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五His,β-gal自激活原理TranscriptionfactorsGAL4BD第八頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五YPDA液體500ml固體100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g瓊脂——2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培養(yǎng)基0.2gade定容至100ml→0.2%的ade母液pH6.5滅菌121℃15min第九頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五正對(duì)照：pGAL4負(fù)對(duì)照：pBD-GAL4第十頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五將-70℃下凍存的酵母菌在YPAD平板上劃線，倒置于30℃培養(yǎng)2-3天。挑取2-4個(gè)大菌落（直徑2-3mm）于1.5mlYPAD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩5min，打散菌落，接種于50mlYPAD液體培養(yǎng)基中（250ml三角瓶），230-250轉(zhuǎn)/min，30℃培養(yǎng)18-24hr。取菌液測定其OD600值，需達(dá)到1.5。若不到，再培養(yǎng)1~2hr，若還不到，換單克隆重?fù)u。取50ml菌液于300mlYPAD培養(yǎng)基中（1-2L大三角瓶），30℃，230rpm，搖培3hr，至OD600值為0.4~0.6。4000rpm5min于常溫收集菌體，重復(fù)一次。室溫下1000g離心5min，去上清，加入50ml超純水清洗懸浮3次。1000g離心5min，棄上清，用新配的1.5ml1×TE/LiAc重懸細(xì)胞，置冰上，即成為酵母感受態(tài)細(xì)胞。（只能現(xiàn)做現(xiàn)用，不能貯存，室溫只能放置1-2hr）。酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞制備：第十一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五

酵母轉(zhuǎn)化鮭魚精DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷卻10min。加入100μl酵母感受態(tài)細(xì)胞、1~2μl構(gòu)建質(zhì)粒（約200ng）、100μg鮭魚精、600μlTE-LiAc-PEG，變速渦旋10s~1min至混勻。30℃，200rpm/min，恒溫?fù)u床振蕩30min。加入70μlDMSO，溫和顛倒混勻。42℃水浴熱休克15min，后冰浴10min。常溫下，3000rpm離心10s；棄上清（去干凈），用0.5ml1×TE重懸細(xì)胞。（1×TE室溫只能放置1~2hr）將轉(zhuǎn)化后的酵母培養(yǎng)于SD/-Trp培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)約3-5天，直至出現(xiàn)菌落。第十二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五陽性克隆的篩選：將在SD/-Trp培養(yǎng)基上長出的酵母菌落轉(zhuǎn)移到SD/-His培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。30℃培養(yǎng)2天，檢查生長情況。對(duì)生長狀態(tài)較好的單克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析。第十三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五β-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆濾紙顯色分析）取2ml的Z緩沖液/X-gal溶液潤透2張濾紙；小心取一張濾紙覆蓋于生長有轉(zhuǎn)化子的平皿上，用涂布棒小心趕出氣泡，使濾紙盡可能與酵母菌接觸（1min）；用一根針在濾紙上刺個(gè)小孔以標(biāo)記菌落位置，用鑷子輕輕取出濾紙，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夾出濾紙，室溫解凍；重復(fù)3次；沾有菌的面朝上，緊貼于預(yù)先用Z緩沖液/X-gal溶液潤透過的那張濾