分子生物學(xué)討論課討論題

討論題目：已知目的基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AK135903.1），擬采用基因工程技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)該序列中的133-1941位核苷酸序列，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分根據(jù)133-1941的序列，設(shè)計(jì)PCR引物從cDNA中擴(kuò)增該序列得到擴(kuò)增產(chǎn)物后將產(chǎn)物插入質(zhì)粒該質(zhì)粒擴(kuò)增后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，純化后進(jìn)行表達(dá)1234我們的方案：本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分根據(jù)133-1941的序列，設(shè)計(jì)PCR引物本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分引物設(shè)計(jì)目的、原理及原則1搜索、設(shè)計(jì)引物3學(xué)習(xí)使用GenBank2根據(jù)原則篩選引物4本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分引物設(shè)計(jì)的目的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的原理1、擇合適的靶序列：設(shè)計(jì)引物之前，必須分析待測(cè)靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

2、長(zhǎng)度：一般來(lái)說(shuō)，寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15～30bp。

3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般不超過(guò)2℃。

4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般為40～60％。

5、堿基的隨機(jī)分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C。

6、引物自身：引物自身不存在連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，否則會(huì)影響到引物與模板之間的復(fù)性結(jié)合，尤其避免3’末端的互補(bǔ)。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分引物的設(shè)計(jì)原則（詳見(jiàn)課本P.164）①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。③引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分

GenBank是一個(gè)有來(lái)自于70,000多種生物的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。每條紀(jì)錄都有編碼區(qū)（CDS）特征的注釋?zhuān)€包括氨基酸的翻譯。GenBank屬于一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)際合作組織，包括EMBL和DDBJ?？墒褂盟业桨行蛄?。

本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分1.從/nuccore/網(wǎng)站中對(duì)該基因進(jìn)行搜索，輸入登錄號(hào)：AK135903.1本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分2.查詢(xún)可知其序列為本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分3.直接在genbank中得到的引物序列結(jié)果pair3、pair5的3'端有三個(gè)連續(xù)的堿基，舍去。pair1的3'端末尾有堿基A，舍去。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分pair6，pair7的3'端末尾是堿基A，舍去。所以，可用的引物序列為：pair2、pair4本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分搜索引物本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分

點(diǎn)擊getprimers后得到不同的引物方案本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分從cDNA中擴(kuò)增該序列本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA

2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl；

（2）加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50μl。輕輕混勻，離心；

（3）設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照；

（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果；

（5）密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。一、PCR本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分主要原料模板DNATaqDNA聚合酶引物（提前設(shè)計(jì)并合成與目的DNA兩側(cè)互補(bǔ)的引物，瓊脂糖凝膠電泳，分離和純化PCR產(chǎn)物-）二、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分得到擴(kuò)增產(chǎn)物后將產(chǎn)物插入質(zhì)粒本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分真核表達(dá)載體質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)便于篩選重組質(zhì)粒的抗生素抗性基因:四環(huán)素抗性基因Tetr便于篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物抗性基因:氨芐青霉素抗性基因Ampr真核表達(dá)元件:，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)和poly(A)加尾信號(hào)（保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠有效地加上poly(A)）?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分表達(dá)載體構(gòu)建流程獲得人工質(zhì)粒載體分子(pBR322)用限制性核酸內(nèi)切酶（BamHI：GGATCC）切割目的基因DNA片段與運(yùn)載體堿性磷酸酶處理載體（去掉線(xiàn)性DNA分子5‘端磷酸根，防止質(zhì)粒自身環(huán)化，便于與目的基因片段連接）用DNA連接酶連接運(yùn)載體和目的基因本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分轉(zhuǎn)染與純化本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分原理：

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分轉(zhuǎn)染的步驟細(xì)胞傳代(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開(kāi)。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。8）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分第二次細(xì)胞傳代1）在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。2）再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。3）在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分PCR的純化原理PCR產(chǎn)物一般都含有過(guò)量的引物、TagDNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的酶切、雙脫氧PCR測(cè)序反應(yīng)等過(guò)程，因此有必要除去。

目前核酸純化的方法有很多，商用化試劑盒的出現(xiàn)使得DNA的純化過(guò)程變得更加簡(jiǎn)便快捷。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分3、再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。2、加等體積氯仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中.這樣抽提一次，可除去覆蓋在表面的礦物油。4、在水相中加300μl95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。.JPG（一）酚/氯仿法1、取反應(yīng)產(chǎn)物加100μlTE.。本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分5、在小離心機(jī)上10000rpm離心10min，吸凈上清液。加入1ml70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7mlddH2O中，待用。.（一）酚/氯仿法本文檔共30頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期二\10點(diǎn)32分（二）WizardPCRDNA純化系統(tǒng)WizardPCRDNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測(cè)序、標(biāo)記、克隆等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50mlWizardPCRDNA純化樹(shù)脂5ml直接提取緩沖液50支Wizard微型柱本文檔共3