基因工程基因工程的工具酶

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:glzhou@:448953745基因工程

GeneticEngineering1本文檔共165頁；當前第1頁；編輯于星期二\12點25分Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745第2章基因工程的工具酶2本文檔共165頁；當前第2頁；編輯于星期二\12點25分Enzymesinvolvedingeneticengineering1.Restrictionenzymes-cuttingDNA（切割）基因工程中常用的三大類工具酶分別與DNA的切割、修飾、連接有關。2.DNAmodifyingenzymes

（修飾）3.DNAligase-joiningDNA（連接）Nucleases（核酸酶）Polymerases（聚合酶）EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules

（末端修飾酶）本文檔共165頁；當前第3頁；編輯于星期二\12點25分基因工程中常用的三大類酶分別與DNA的修飾、切割、連接有關。本文檔共165頁；當前第4頁；編輯于星期二\12點25分Contents1.限制性核酸內(nèi)切酶2.DNA修飾酶3.DNA連接酶本文檔共165頁；當前第5頁；編輯于星期二\12點25分重點與難點內(nèi)容各種工具酶概念及其基本性質(zhì)各種工具酶在基因工程中的應用限制酶與修飾酶重點基因工程工具酶的應用難點本文檔共165頁；當前第6頁；編輯于星期二\12點25分1.Restrictionendonuclease（限制性核酸內(nèi)切酶）一類能識別dsDNA分子內(nèi)部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸酶來源：主要從原核生物中分離純化而來II型核酸內(nèi)切酶：2300種以上，可識別230種不同的DNA序列（1994年，美國，分子生物學百科全書）目前發(fā)現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶的生物主要是細菌，少數(shù)霉菌和藍藻。Todate,over10000microbesfromaroundtheworldhavebeenscreenedforrestrictionenzymes.Fromthese,over3000enzymeshavebeenfoundrepresentingapproximately200differentsequencespecificities.*本文檔共165頁；當前第7頁；編輯于星期二\12點25分Discoverofrestractionendonulease這種大自然賦予基因工程學家的了不起的禮物是如何發(fā)現(xiàn)的呢?本文檔共165頁；當前第8頁；編輯于星期二\12點25分1.1寄主控制的限制與修飾限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）大多數(shù)的細菌對于噬菌體的感染都存在這一些功能性障礙。如：目前尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種既可感染假單胞菌又可感染大腸桿菌的噬菌體，且非寄主細菌的RNA聚合酶不能夠識別“外源”噬菌體的啟動子，即使噬菌體的吸附和轉(zhuǎn)錄能進行，也仍然存在這一功能障礙——即為寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象——吳乃虎，基因工程（第二版，上冊），P122*本文檔共165頁；當前第9頁；編輯于星期二\12點25分1.1寄主控制的限制與修飾限制

（Host-controlledrestrictionandmodification）瑞士學者W.Arber1952年發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，1978年獲得諾貝爾獎。WernerArber*這種現(xiàn)象類似于人體的免疫系統(tǒng)，它可辨別自身的DNA和外來的DNA，并使后者降解——它是限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)的基礎。本文檔共165頁；當前第10頁；編輯于星期二\12點25分PhenomenonKλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制為什么呢？本文檔共165頁；當前第11頁；編輯于星期二\12點25分說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA；10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結果

EOP:Efficiencyofplating(生長在不同寄主中的λ噬菌體的成斑率，表示限制程度)。本文檔共165頁；當前第12頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第13頁；編輯于星期二\12點25分Whatisthereason研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶（1962年）？甲基化酶：能使自身的內(nèi)切酶識別序列的堿基發(fā)生甲基化，從而使自身DNA免受內(nèi)切酶切割而降解——細菌的“防御”系統(tǒng)（盾）核酸內(nèi)切酶：識別并切割酶解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護）（矛）限制一修飾體系：其功能就是保護自身的DNA，分解外來的DNA本文檔共165頁；當前第14頁；編輯于星期二\12點25分用這兩種酶來解釋：

Host-controlledrestrictionandmodification再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（因為菌株的甲基化酶已經(jīng)對其進行了修飾，加以保護）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，形成的嗜菌斑非常少（因為其DNA大部分被胞內(nèi)的內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。）*Kλ（B）λ（K）Kλ（K）本文檔共165頁；當前第15頁；編輯于星期二\12點25分是指一定類型的細菌可以通過限制性內(nèi)切酶的作用，降解入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細胞的入侵受到限制。*限制作用本文檔共165頁；當前第16頁；編輯于星期二\12點25分是指生物細胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過甲基化酶的修飾，免遭自身限制性酶的破壞。限制一修飾體系，其功能就是保護自身的DNA，分解外來的DNA，以保護和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細菌的生存和繁衍具有重要意義。*修飾作用本文檔共165頁；當前第17頁；編輯于星期二\12點25分1.2限制性內(nèi)切酶的類型

Typesofrestrictionandmodification(R-M)systemTypeI(1%):種類少TypeII:98%TypeIII:(<1%)I型和III型:通常都是大型的多亞基的蛋白復合物，既有內(nèi)切酶的活性，又有甲基化酶活性。輔助因子也較多，除了鎂離子外，還需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），這樣才能表現(xiàn)出正常的限制活性。本文檔共165頁；當前第18頁；編輯于星期二\12點25分TypeIRE識別位點：未甲基化修飾的15bp左右特異序列，非對稱性。酶切位點：在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈本文檔共165頁；當前第19頁；編輯于星期二\12點25分作用機理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。I型限制性內(nèi)切酶具有極強的ATPase的活性，每打開一個磷酸二脂鍵就需要消耗1000個分子的ATP。因酶切位點不特異，在基因工程中無意義【★】

。本文檔共165頁；當前第20頁；編輯于星期二\12點25分TypeIII

REIII型限制性內(nèi)切酶兼有限制-修飾兩種功能，可以特異地識別DNA，但酶切位點在識別位點下游5～15bp的地方。輔酶：ATP和Mg2+在基因工程的意義？？本文檔共165頁；當前第21頁；編輯于星期二\12點25分TypeIIRE：基因工程中重要的工具酶！！精彩馬上開始！本文檔共165頁；當前第22頁；編輯于星期二\12點25分（一）TypeIIRE：限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)特征1.Recognitionsequencessize：4-8bp，多數(shù)6bp*2.結構特征：rotationalsymmetry-“palindromes”（旋轉(zhuǎn)對稱的回文結構）3.切割后產(chǎn)生的末端：CohesiveterminusorBluntend（粘性末端或平末端）本文檔共165頁；當前第23頁；編輯于星期二\12點25分例1：EcoRI的識別序列回文序列：指在雙鏈DNA序列中按確定的方向閱讀，雙鏈中的每一條鏈的序列都是相同的。Recognitionsequence(識別序列)本文檔共165頁；當前第24頁；編輯于星期二\12點25分簡并識別序列有些酶的識別序列不是一個，而是多個。在基因重組時要盡量少用這些酶例2：本文檔共165頁；當前第25頁；編輯于星期二\12點25分Cuttingsite（切割位點）切割位點多數(shù)在識別序列的內(nèi)部，少數(shù)在兩端，部分在兩翼。部分在兩翼少數(shù)兩側/端多數(shù)在內(nèi)部本文檔共165頁；當前第26頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第27頁；編輯于星期二\12點25分Sitepreference（偏愛位點）CertainrestrictionendonucleasesshowpreferentialcleavageofsomesitesinthesameDNAmolecule.相同的DNA分子，有些限制性內(nèi)切酶會對一些位點表現(xiàn)出偏愛性的切割。這些位點就是限制性內(nèi)切酶的偏愛位點。切割位點兩側序列的核苷酸組成與切割效率有關，即某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割。*本文檔共165頁；當前第28頁；編輯于星期二\12點25分Sitepreference（偏愛位點）原因1.邊界堿基的輔助識別：與識別序列鄰近的特異性邊界堿基可以提高酶切速度，對酶的識別起到輔助作用。2.甲基化：限制酶識別序列內(nèi)或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，會阻礙限制酶的活性。（限制與修飾現(xiàn)象。受甲基化影響的酶在商品說明書中都會有標示。）3.底物的構象：DNA分子的不同構型對限制酶的活性也有很大影響。有些酶切割超螺旋DNA和線狀DNA時會表現(xiàn)出差異。*本文檔共165頁；當前第29頁；編輯于星期二\12點25分Cohesiveterminusandbluntend（粘性或平末端）1.Cohesiveterminus(end)(粘性末端）：在對稱軸5’側或3’切割底物,使得DNA雙鏈交錯斷開，產(chǎn)生具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。*2.Bluntorflushend(平端)：在對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈，產(chǎn)生的末端平整，不易于重新環(huán)化。3.非互補的粘性末端：酶切位點在識別序列之外的。本文檔共165頁；當前第30頁；編輯于星期二\12點25分①5’粘性末端(protruding5'ends)本文檔共165頁；當前第31頁；編輯于星期二\12點25分②3’粘性末端(protruding3'ends)本文檔共165頁；當前第32頁；編輯于星期二\12點25分③平末端（BluntEnd）本文檔共165頁；當前第33頁；編輯于星期二\12點25分④非互補的粘性末端本文檔共165頁；當前第34頁；編輯于星期二\12點25分粘性末端的意義或者在基因工程中的作用①連接便利a)不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平末端要容易的多。b)同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。本文檔共165頁；當前第35頁；編輯于星期二\12點25分②末端標記a)凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。或者用DNA聚合酶補平5’粘性末端來標記。b)凸出的3’末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端或標記。③補平或削平成平末端5’粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平末端。3’粘性末端可以用T4DNAPol或S1酶削平成平末端。本文檔共165頁；當前第36頁；編輯于星期二\12點25分（二）TypeIIRE：稀切酶、同裂酶與同尾酶稀切酶（rarecuttingenzymes）在DNA分子中出現(xiàn)的幾率低，故稱之為稀切酶。識別序列比較長；富含AT或富含GC。本文檔共165頁；當前第37頁；編輯于星期二\12點25分同裂酶(Isoschizomer)【★】

來源不同的II型限制性內(nèi)切酶，具有相同的識別序列時，稱為同裂酶(Isoschizomer)。有2種情況：①酶切以后的殘端完全相同：②酶切以后的殘端不同：本文檔共165頁；當前第38頁；編輯于星期二\12點25分同尾酶(Isocandamers)【★】

來源不同，識別序列也各不相同，但酶切以后的殘端相同，這種情況稱為同尾酶(Isocandamers).由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段可通過粘性末端之間的互補作用而連接。在基因克隆中很有用！本文檔共165頁；當前第39頁；編輯于星期二\12點25分同尾酶的粘性末端互相結合后開成的新位點一般不能在被原來的酶識別,WHY？Q：你能推斷出這兩個酶的識別序列嗎？I本文檔共165頁；當前第40頁；編輯于星期二\12點25分Qize用限制酶將Sau3AI(↓GATC)切割的DNA與經(jīng)BamHI(G↓GATCC)切割的DNA連接起來后，能夠被BamHI切割的幾率有多少？本文檔共165頁；當前第41頁；編輯于星期二\12點25分（三）TypeIIRE：切點在DNA上出現(xiàn)的頻率II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點在DNA上出現(xiàn)的頻率受DNA的長度、識別位點的長度以及GC含量的影響。4bp的識別位點：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的識別位點：1/46＝4096bp如EcoRIGAATTC本文檔共165頁；當前第42頁；編輯于星期二\12點25分（四）TypeIIRE：甲基化對活性的影響大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一個胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性內(nèi)切酶對甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法：本文檔共165頁；當前第43頁；編輯于星期二\12點25分①選用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA識別切割位點與MboI相同，但不受甲基化影響；②利用甲基化酶缺失的受體細胞進行DNA的制備，如E.coliJM110和鏈霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者細胞內(nèi)本就沒有甲基化酶，從這些細胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。本文檔共165頁；當前第44頁；編輯于星期二\12點25分（五）TypeIIRE：對單鏈DNA的活性對單鏈DNA沒有作用，但局部有雙鏈結構時可以特異性地切斷。DNA和RNA的雜交產(chǎn)物也是雙鏈結構?？梢郧袛唷１疚臋n共165頁；當前第45頁；編輯于星期二\12點25分（五）TypeIIRE：對寡核苷酸的活性盡管是雙鏈、有識別位點，但因為太短，酶不能與DNA有效結合，所以不能切割。當2個酶切位點距離非常近的時候，它們之間由于競爭結合位點，所以也會相互干擾。本文檔共165頁；當前第46頁；編輯于星期二\12點25分（六）TypeIIRE：Nomenclature(命名法)Thespeciesnameofthehostorganismisidentifiedbythefirstletterofthegenusnameandthefirsttwolettersofthespecificepithet

togenerateathree-letterabbreviation.Thisabbreviationisalwayswritteninitalics（屬名的第一個字母+種名的頭兩個字母，拉丁文）.Whereaparticularstrainhasbeenthesourcethenthisisidentified.（菌株型號）WhenaparticularhoststrainhasseveraldifferentR-Msystems,theseareidentifiedbyromannumerals（在這個宿主中發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶的順序，羅馬數(shù)字）.*本文檔共165頁；當前第47頁；編輯于星期二\12點25分注意：前三個字母一定要用斜體，各字之間沒有空格！本文檔共165頁；當前第48頁；編輯于星期二\12點25分（七）TypeIIRE：reactivesystem（反應系統(tǒng)）Substrate(底物)：純，線性，有保護序列Enzyme(酶)：樣品，識別序列的密度，容積活性Buffer(反應緩沖液)。DNA（2ug/ul）5ul10X反應液5ul酶（5ug/ul）5ulddH2O

35ul總體積50μL37℃保溫2-3小時（時間不定）本文檔共165頁；當前第49頁；編輯于星期二\12點25分Substrate（底物）1）DNA純度：要求較純因素：蛋白質(zhì)、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高濃度金屬離子措施：增加酶的用量；擴大反應系統(tǒng)體積;延長反應時間；添加亞精胺*本文檔共165頁；當前第50頁；編輯于星期二\12點25分Substrate（底物）核酸限制性內(nèi)切酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中，所用的載體（質(zhì)粒DNA）是來源于甲基化酶缺陷型的大腸桿菌菌株。

這樣制備的質(zhì)粒DNA，其中的內(nèi)切酶識別序列沒有甲基化，不受限制。*2)DNA的甲基化程度：不能有甲基化someorallofthesitesforarestrictionendonucleasemayberesistanttocleavagewhenisolatedfromstrainsexpressingtheDcmorDammethylases.

themodificationstateofplasmidDNAcanaffectthefrequencyoftransformationinspecialsituations.

本文檔共165頁；當前第51頁；編輯于星期二\12點25分3）DNA分子構型

效率：線性DNA分子>超螺旋質(zhì)粒DNA\環(huán)狀病毒DNA本文檔共165頁；當前第52頁；編輯于星期二\12點25分4）識別序列的側面序列

限制酶切割DNA，對識別序列兩側的非識別序列有長度要求，只含識別序列的寡核苷酸其酶切效率很低，故PCR擴增目的序列時通常要在識別序列兩側多加若干個核苷酸，以便擴增后的序列方便切割（例：見下圖）*本文檔共165頁；當前第53頁；編輯于星期二\12點25分Incorporationofextrasequenceatthe5’endofaprimer.Twoprimershavesequencesdesignedtohybridizeattheendsofthetargetregion.Primer1hasanextrasequencenearits5’endwhichformsaHindIIIsite(AAGCTT),andprimer2hasanextrasequencenearits5’endwhichformsanEcoRI(GAATTC)site.Eachprimerhasanadditional5’-terminalsequenceoffournucleotidessothatthehexanucleotiderestrictionsitesareplacedwithintheextremeendsoftheamplifiedDNA,andsopresentgoodsubstratesforendonucleasecleavage.本文檔共165頁；當前第54頁；編輯于星期二\12點25分小提示：試劑公司提供的包裝說明書會標明酶活性單位數(shù)和容積活性，最佳作用條件內(nèi)切酶決定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的樣品1)用量本文檔共165頁；當前第55頁；編輯于星期二\12點25分2)酶活單位1個酶活單位：在最適反應條件下，在20l反應液中反應1小時，使1gDNA（標準DNA）完全消化所需的酶活性稱為1個單位。1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA（λDNA

）所需的酶量容積活性：1μL酶液中具有的酶活性單位，即U/μL。本文檔共165頁；當前第56頁；編輯于星期二\12點25分常規(guī)緩沖液(10X)

pH，Mg++，DTT/β-ME，①pH:7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl②離子強度：NaCl

高中低100mM50mM0③Mg++:10mMMgCl2

，MgAc反應緩沖液對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=7.4的條件下，其功能最佳。0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。本文檔共165頁；當前第57頁；編輯于星期二\12點25分④反應條件大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標準反應溫度都是37℃一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時,活性多數(shù)為10-50%。小提示：銷售商在產(chǎn)品說明中會標明最佳反應溫度不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應溫度，而且彼此之間有相當大的變動范圍。本文檔共165頁；當前第58頁；編輯于星期二\12點25分（七）TypeIIRE：星號活性（staractivity）Underextremeconditions,suchaselevatedpHorlowionicstrength,restrictionendonucleasesarecapableofcleavingsequenceswhicharesimilarbutnotidenticaltotheirdefinedrecognitionsequence.Thealteredspecificityisknownasstaractivity.高濃度的酶（>100U/g）、高濃度的甘油（>5%）、低離子強度（<25mM）、極端pH值(>pH8.0)等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性（專一性降低），即所謂的staractivity現(xiàn)象低特異性：可在不是原來的識別序列處切割DNA是限制內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點*本文檔共165頁；當前第59頁；編輯于星期二\12點25分引起星號活性的因素①反應體系中甘油的濃度大于5%。②酶用量過大，大于100U/μgDNA。③低離子強度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有機劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。本文檔共165頁；當前第60頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第61頁；編輯于星期二\12點25分抑制staractivity的措施①減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度②保證反應體系中無有機溶濟或乙醇③提高離子強度到100～150mM(如果不會抑制的話)④降低反應pH至pH7.0⑤使用Mg2+作為二價陽離子*本文檔共165頁；當前第62頁；編輯于星期二\12點25分QuizQ：當兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應采取什么措施?為什么?注意staractivity，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號活性。或使用通用緩沖液同時使用兩種酶進行酶切。本文檔共165頁；當前第63頁；編輯于星期二\12點25分（八）TypeIIRE：cuttingDNA單酶切雙酶切部分酶切本文檔共165頁；當前第64頁；編輯于星期二\12點25分單酶切法環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生與識別序列數(shù)（n）相同的DNA片段，且DNA片段的兩末端相同線形DNA分子產(chǎn)生n+1的DNA片段，即：采用一種酶對DNA進行切割本文檔共165頁；當前第65頁；編輯于星期二\12點25分雙酶切法即：采用兩種酶對DNA進行切割。環(huán)狀DNA分子完全酶切DNA片段數(shù)為兩種限制酶識別序列之和:n1+n2線狀DNA分子完全酶切DNA片段數(shù)為兩種限制酶識別序列之和加1:n1+n2+1本文檔共165頁；當前第66頁；編輯于星期二\12點25分重組克隆載體pMD18-T-RIP雙酶切電泳圖M:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ1:BamHI和SacI雙酶切后的重組克隆載體18-T-RIP本文檔共165頁；當前第67頁；編輯于星期二\12點25分部分酶切即：選用的限制性酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全的切割。原因：底物DNA純度低識別序列的甲基化酶用量的不足反應緩沖液不適宜溫度不適宜反應時間不足缺點：

影響需要的DNA片段的得率優(yōu)點：

根據(jù)重組設計的需要，專門創(chuàng)造部分酶切的條件，獲取需要的DNA片段本文檔共165頁；當前第68頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第69頁；編輯于星期二\12點25分可以通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶用量來實現(xiàn)、增大反應體積。本文檔共165頁；當前第70頁；編輯于星期二\12點25分Quiz本文檔共165頁；當前第71頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第72頁；編輯于星期二\12點25分酶切反應如何終止？消化DNA樣品后，在進一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。*本文檔共165頁；當前第73頁；編輯于星期二\12點25分1、限制酶十分昂貴！2、限制酶在50%甘油中保存于-20℃最穩(wěn)定3、盡量減少反應中的加水量4、延長消化時間可使所需酶量減少使用限制酶的注意點：不太常用的限制性內(nèi)切酶多保存在-70℃，每周或每天用的酶保存在-20℃。有一些酶需要不同的保存條件。小提示：使用限制性內(nèi)切酶時，一定要將酶保存在冰上。

本文檔共165頁；當前第74頁；編輯于星期二\12點25分（九）TypeIIRE：影響RE活性的因素本文檔共165頁；當前第75頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第76頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第77頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第78頁；編輯于星期二\12點25分①在特異位點上切割DNA，產(chǎn)生特異限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。（十）TypeIIRE：用途本文檔共165頁；當前第79頁；編輯于星期二\12點25分VariationsoncuttingandjoiningDNAmolecules

（對DNA分子進行切割、連接，綜合運用各種酶，可產(chǎn)生不同的變化）ThegenerationofthreenewrestrictionsitesafterfillingintheoverhangsproducedbyendonucleaseEcoRIandligatingtheproductstogether.Notethattherearetwotargetsites,4bpapart,inthereconstitutedmoleculeforendonucleaseTsp509I.各種不同的工具酶組合，會產(chǎn)生不同的效果。這里需要DNA連接酶穿針引線。本文檔共165頁；當前第80頁；編輯于星期二\12點25分小結本文檔共165頁；當前第81頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第82頁；編輯于星期二\12點25分2.DNAmodifyingenzymesOtherenzymesusedingeneticengineeringmaybelooselytermedDNAmodifyingenzymes,withthetermusedheretoincludedegradation,synthesis,andalterationofDNA.Inadditiontorestrictionendonucleases,thereareseveralothertypesofnucleaseenzymesthatareimportantinthemanipulationofDNA.Someofthemostcommonlyusedenzymesaredescribednext.本文檔共165頁；當前第83頁；編輯于星期二\12點25分2.DNA修飾酶Nucleaseenzymesdegradenucleicacidsbybreakingthephosphodiesterbondthatholdsthenucleotidestogether.Restrictionenzymesaregoodexamplesofendonucleases,whichcutwithinaDNAstrand.*2.1Nucleases（核酸酶）本文檔共165頁；當前第84頁；編輯于星期二\12點25分核酸外切酶（exonuclease）

核酸內(nèi)切酶(endonuclease)核酸酶從核酸鏈的一端開始按順序催化降解核苷酸的酶。從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之斷裂形成小片段希臘文exo為外部之意，endo為內(nèi)部之意。*Q：核酸酶與核酶(ribozyme)之間有何區(qū)別？介紹幾個概念按作用特性的差異,可分為單鏈的核酸外（內(nèi)）切酶和雙鏈的核酸外（內(nèi)）切酶.本文檔共165頁；當前第85頁；編輯于星期二\12點25分2.1.1FourusefulnucleasesApartfromrestrictionenzymes,therearefourusefulnucleasesthatareoftenusedingeneticengineering.TheseareBal31andexonucleaseIII(exonucleases),anddeoxyribonucleaseI(DNaseI)andS1-nuclease(endonucleases).本文檔共165頁；當前第86頁；編輯于星期二\12點25分TheseenzymesdifferintheirprecisemodeofactionandprovidethegeneticengineerwithavarietyofstrategiesforattackingDNA.TheirfeaturesaresummarisedinFig.本文檔共165頁；當前第87頁；編輯于星期二\12點25分Fig.4.5Modeofactionofvariousnucleases.(a)NucleaseBal31isacomplexenzyme.Itsprimaryactivityisafast-acting3exonuclease,whichiscoupledwithaslow-actingendonuclease.WhenBal31ispresentatahighconcentrationtheseactivitieseffectivelyshortenDNAmoleculesfrombothtermini.(b)ExonucleaseIIIisa3exonucleasethatgeneratesmoleculeswithprotruding5termini.(c)DNaseIcutseithersingle-strandedordouble-strandedDNAatessentiallyrandomsites.(d)NucleaseS1isspecificforsingle-strandedRNAorDNA.本文檔共165頁；當前第88頁；編輯于星期二\12點25分具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性和雙鏈特異的核酸外切酶活性。本文檔共165頁；當前第89頁；編輯于星期二\12點25分Bal31用于定位本文檔共165頁；當前第90頁；編輯于星期二\12點25分應用Bal31

核酸酶誘發(fā)DNA分子的缺失突變（a）質(zhì)粒DNA分子，A區(qū)段是準備誘發(fā)缺失突變的序列（b）用Bal31核酸酶不同時間長度分別消化線性DNA分子，得到缺失長度不等的分子群體（c）將帶有另一種限制性內(nèi)切酶識別序列的銜接物連接到這些缺失分子上并將它們環(huán)化起來（d）新形成的環(huán)狀質(zhì)粒分子具有新的限制性內(nèi)切酶（HindIII）的切點，其A區(qū)段有缺失本文檔共165頁；當前第91頁；編輯于星期二\12點25分S1核酸酶的用途1）定位RNA2）用mRNA測定基因中的外顯子序列不能配對的內(nèi)含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉！本文檔共165頁；當前第92頁；編輯于星期二\12點25分S1核酸酶的活性本文檔共165頁；當前第93頁；編輯于星期二\12點25分S1定位RNA本文檔共165頁；當前第94頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第95頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第96頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第97頁；編輯于星期二\12點25分2.1.2其它核酸外切酶1）大腸桿菌核酸外切酶VII（單鏈）能從5’或3’末端降解DNA分子,而且是所討論的唯一的不需要Mg2+的核酸酶.本文檔共165頁；當前第98頁；編輯于星期二\12點25分2）大腸桿菌核酸外切酶III（雙鏈）1.特點：來自E.coli，主要作用于ds-DNA,3’→5’外切酶活性，不降解ss-DNA.2.催化反應類型（1）外切酶活性（2）核酸酶H活性（RNaseH活性）（3）內(nèi)切酶活性3.用途（1）核酸（DNA）標記（2）產(chǎn)生缺口（3）DNA序列順序缺失

(4)還可作為雙脫氧DNA序列分析法的反應底物,即制備單鏈DNA模板.

本文檔共165頁；當前第99頁；編輯于星期二\12點25分2）大腸桿菌核酸外切酶III（雙鏈）RNaseH活性本文檔共165頁；當前第100頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第101頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第102頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第103頁；編輯于星期二\12點25分3）λ噬菌體核酸外切酶（雙鏈核酸外切酶）從單、雙鏈DNA的5’-PO4基末端逐步切下5’-PO4

單核苷酸，不能降解5’-OH端主要用途是將雙鏈DNA變?yōu)閱捂?，供測序使用；除去5’-端突起，產(chǎn)生3’-端突起，便于加尾本文檔共165頁；當前第104頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第105頁；編輯于星期二\12點25分2.1.3RibonucleasesInadditiontoDNA-specificnucleases,thereareribonucleases(RNases),whichactonRNA.ThesemayberequiredformanyofthestagesinthepreparationandanalysisofrecombinantsandareusuallyusedtogetridofunwantedRNAinthepreparation.本文檔共165頁；當前第106頁；編輯于星期二\12點25分However,aswellasbeinguseful,ribonucleasescanposesomeunwantedproblems.Why?本文檔共165頁；當前第107頁；編輯于星期二\12點25分Theyareremarkablydifficulttoinactivateandcanbesecretedinsweat.Thus,contaminationwithRNasescanbeaprobleminpreparingrecombinantDNA,particularlywherecDNAispreparedfromanmRNAtemplate.本文檔共165頁；當前第108頁；編輯于星期二\12點25分InthiscaseitisvitaltoavoidRNasecontaminationbywearingglovesandensuringthatallglassandplasticequipmentistreatedtoavoidribonucleasecontamination.本文檔共165頁；當前第109頁；編輯于星期二\12點25分Notallnucleasesarehelpful!RibonucleasescanbeaproblemwhenworkingwithpurifiedpreparationsofRNA,andcaremustbetakentoremoveorinactivateRNaseactivity.本文檔共165頁；當前第110頁；編輯于星期二\12點25分2.2Polymerases（聚合酶）Polymerasesarethecopyingenzymesofthecell;theyarealsoessentialpartsofthegeneticengineer’sarmoury.Theseenzymesaretemplate-dependentandcanbeusedtocopylongstretchesofDNAorRNA.Polymeraseenzymessynthesisecopiesofnucleicacidmoleculesandareusedinmanygeneticengineeringprocedures.本文檔共165頁；當前第111頁；編輯于星期二\12點25分2.2Polymerases（聚合酶）定義：EnzymesthatsynthesizeanewstrandofDNAcomplementarytoanexistingDNAorRNAtemplate.*本文檔共165頁；當前第112頁；編輯于星期二\12點25分Whendescribingapolymeraseenzyme,theterms‘DNA-dependent’or‘RNA-dependent’maybeusedtoindicatethetypeofnucleicacidtemplatethattheenzymeuses.Thus,aDNA-dependentDNApolymerasecopiesDNAintoDNA,anRNA-dependentDNApolymerasecopiesRNAintoDNA,andaDNA-dependentRNApolymerasetranscribesDNAintoRNA.本文檔共165頁；當前第113頁；編輯于星期二\12點25分Thesynthesisproceedsina5'→3'direction,aseachsubsequentnucleotideadditionrequiresafree3'-OHgroupfortheformationofthephosphodiesterbond.Thisrequirementalsomeansthatashortdouble-strandedregionwithanexposed3'-OH(aprimer)isnecessaryforsynthesistobegin.本文檔共165頁；當前第114頁；編輯于星期二\12點25分FourtypesofDNApolymereasesusuallyusedingeneticengineering（4種常見的聚合酶）:1.共同特點：把dNTP連續(xù)地加到dsDNA分子的3’-羥基端，催化DNA分子聚合，而引物不從DNA模板上解離。2.主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。本文檔共165頁；當前第115頁；編輯于星期二\12點25分2.2Polymerases（聚合酶）*1)DNApolymereaseI（FromE.coli,109kDa）2)Klenowfragment=E.coliDNApolymeraseIlargefragment(76kDa),枯草桿菌蛋白酶裂解DNApolymereaseI,從全酶中除去5’—3’外切酶活性片段，而聚合酶活性和3’—5’外切酶活性不受影響。3)TaqDNApolymerase4)Reversetranscriptase本文檔共165頁；當前第116頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第117頁；編輯于星期二\12點25分大腸桿菌DNA聚合酶I（DNAPOLYMERASEI）①基本性質(zhì)本文檔共165頁；當前第118頁；編輯于星期二\12點25分②基本用途

本文檔共165頁；當前第119頁；編輯于星期二\12點25分大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(KLENOWFRAGMENT)【★】

①Klenow酶的基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，PolI就裂解為大小不同的兩個活性片段，較大的C端片段具有聚和酶和3’

-5’核酸外切酶活性但失去了5`→3`的核酸外切酶活性，即Klenow酶。本文檔共165頁；當前第120頁；編輯于星期二\12點25分目前以將DNA聚合酶基因內(nèi)的相應編碼序列克隆表達，并由重組大腸桿菌廉價生產(chǎn)。本文檔共165頁；當前第121頁；編輯于星期二\12點25分②KLENOW酶的基本用途A.補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3′粘性凹進末端或5′粘性凸出末端；抹平DNA的3′粘性凸出末端本文檔共165頁；當前第122頁；編輯于星期二\12點25分B.DNA片段的同位素末端標記本文檔共165頁；當前第123頁；編輯于星期二\12點25分

C.cDNA第二鏈的合成

D.雙脫氧末端終止法測定DNA序列本文檔共165頁；當前第124頁；編輯于星期二\12點25分T4DNA聚合酶(T4PHAGEDNAPOLYMERASE)【★】

①T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切。在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸。在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位。本文檔共165頁；當前第125頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第126頁；編輯于星期二\12點25分②基本用途

本文檔共165頁；當前第127頁；編輯于星期二\12點25分本文檔共165頁；當前第128頁；編輯于星期二\12點25分TaqDNApolymerase從棲熱水生菌（Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶。63kDaActivities:5′3DNApolymerase5′3exonuclease(無35′外切酶作用，因此無校正功能)特點：thermo-stable(耐高溫)。應用：PCR反應中常用。*知識提升：TaqDNA聚合酶的特性:在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸(優(yōu)先加A).本文檔共165頁；當前第129頁；編輯于星期二\12點25分SourcesofthermostableDNApolymerasewithproofreading(3’-5’exonuclease)acitivity本文檔共165頁；當前第130頁；編輯于星期二\12點25分T7DNA聚合酶1．來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基，有5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，增加大亞基對模板的親和性。本文檔共165頁；當前第131頁；編輯于星期二\12點25分2．T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強，一旦與模板結合就會不間斷地合成互補鏈。②3’-5’外切酶活性高，單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結構的影響。其它DNA聚合酶受DNA二級結構的阻礙本文檔共165頁；當前第132頁；編輯于星期二\12點25分3．T7DNA聚合酶的用途①以大分子量DNA為模板的合成②進行末端標記。取代合成法標記3’末端，這與T4DNA聚合酶相同。③補平隱蔽末端。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。

本文檔共165頁；當前第133頁；編輯于星期二\12點25分修飾后的T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶的化學修飾是去除了其3’-5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修飾后的T7DNA聚合酶的用途：①雙脫氧法DNA測序；②標記DNA3’隱蔽末端；③更有效地補平末端。

本文檔共165頁；當前第134頁；編輯于星期二\12點25分Reversetranscriptase(反轉(zhuǎn)錄酶)反轉(zhuǎn)錄酶具有5’→3’的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈，同時又具有3’→5’和5’→3’的RNA外切核酸酶活性（

RNaseH活性）。*本文檔共165頁；當前第135頁；編輯于星期二\12點25分Reversetranscriptase(反轉(zhuǎn)錄酶)1．Variety：兩種商品化的反轉(zhuǎn)錄酶（兩個來源）AMV禽成髓細胞瘤病毒

Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒2.Activities：

5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNaseH活性3．Application：cDNA克隆5’突出DNA的3’端補平測序反應(代替Klenow大片段)*本文檔共165頁；當前第136頁；編輯于星期二\12點25分2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmoleculesAlkalinephosphatase(堿性磷酸酶，去除5’磷酸基團)Function：Removesthephosphategrouppresentatthe5’terminusofaDNAmolecule.去除DNA分子5’末端的磷酸基團（若用于載體DNA5’末端，則可防止DNA片段自身聚合狀）*本文檔共165頁；當前第137頁；編輯于星期二\12點25分Alkalinephosphatase

(堿性磷酸酶)ApplicationofalkalinephosphatasetreatmenttopreventrecircularizationofvectorplasmidwithoutinsertionofforeignDNA.堿性磷酸酶可使被切開后的載體去磷酸化，防止其自身環(huán)化。①克隆時去除載體的5’-P，以防載體自連它的應用本文檔共165頁；當前第138頁；編輯于星期二\12點25分②在用激酶進行5’末端標記前，去除DNA的5’-P本文檔共165頁；當前第139頁；編輯于星期二\12點25分2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶，在5’端增加磷酸基團)Organism：FromE.coliinfectedwithT4phageFunction：Addphosphategroupsontofree5’terminus.給DNA5’末端增加磷酸基團，形成自由的5’-P，以利于DNA的連接。本文檔共165頁；當前第140頁；編輯于星期二\12點25分Polynucleotidekinase(多核苷酸激酶)TheforeignDNAplusligatedadaptorsisphosphorylatedatthe5’-terminibypolynuleotidekinase.多核苷酸激酶可使5’末端發(fā)生磷酸化，使之能與DNA3’末端正常連接。本文檔共165頁；當前第141頁；編輯于星期二\12點25分用途:1)5’-端末端標記本文檔共165頁；當前第142頁；編輯于星期二\12點25分2)分子克隆過程中獲得5’-磷酸基末端，便于連接酶反應本文檔共165頁；當前第143頁；編輯于星期二\12點25分它能進行兩種反應本文檔共165頁；當前第144頁；編輯于星期二\12點25分2.3EnzymesthatmodifytheendsofDNAmolecules*Terminaldeoxynucleotidyltransferase(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，末端轉(zhuǎn)移酶)

Organism：Fromcalfthymus(胸腺)tissueFunction：Addsoneormoredeoxyribonucleotides(脫氧核糖核苷酸)ontothe3’terminusofDNAmolecule.催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，催化作用不需要模板。本文檔共165頁；當前第145頁；編輯于星期二\12點25分terminaldeoxynucleotidyltransferase

(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶,末端轉(zhuǎn)移酶)底物：帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物；以3’-突起端的雙鏈DNA為最高，亦可用于雙鏈DNA加尾*本文檔共165頁；當前第146頁；編輯于星期二\12點25分TdT的用途①同聚物加尾：給外源DNA片段和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。同聚物尾巴（homopolymerictail)：當反應混合物中只有一種dNTP時，就可以形成僅由一種核苷酸組成的3’尾巴。稱這種尾巴為同聚物尾巴。本文檔共165頁；當前第147頁；編輯于星期二\12點25分再生酶切位點：克隆片段。本文檔共165頁；當前第148頁；編輯于星期二\12點25分放射性與非放射性標記DNA片段的3’端催化非放射性標記物參入DNA片段的3’端。如生物素-11-dUTP等。本文檔共165頁；當前第149頁；編輯于星期二\12點25分3.DNAligase(DNA連接酶)

E.coli

andphageT4encodeanenzyme,DNAligase,

whichsealssingle-strandednicksbetweenadjacentnucleotidesinaduplexDNAchain.Ingeneticengineeringitisusedtosealdiscontinuitiesinthesugar—phosphatechainsthatarisewhenrecombinantDNAismadebyjoiningDNA‘molecularglue’;withrestrictionmoleculesfromdifferentsources.Itcanthereforebethoughtofasmolecularglue(分子膠水).DNAligaseisessentially‘molecularglue’;withrestrictionenzymes,itprovidesthetoolsforcuttingan