基因工程原理動物細胞的基因轉(zhuǎn)移

（優(yōu)選）基因工程原理動物細胞的基因轉(zhuǎn)移本文檔共40頁；當前第1頁；編輯于星期二\12點24分Introduction動物細胞的基因轉(zhuǎn)移已應用了40多年研究基因功能和調(diào)控或者生產(chǎn)大量的重組蛋白哺乳動物細胞系，桿狀病毒表達系統(tǒng)體內(nèi)基因治療不同于轉(zhuǎn)基因動物2本文檔共40頁；當前第2頁；編輯于星期二\12點24分動物細胞基因轉(zhuǎn)移的策略直接DNA轉(zhuǎn)移

顯微注射，基因槍轉(zhuǎn)染技術(shù)

利用化學和物理技術(shù)誘導細胞從外界環(huán)境攝取DNA病毒介導——轉(zhuǎn)導細菌介導——細菌感染3本文檔共40頁；當前第3頁；編輯于星期二\12點24分轉(zhuǎn)染技術(shù)化學方法

（不同的方法有相似的原理）DNA/磷酸鈣共沉淀法

其他化學方法

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染物理方法

（有多樣的機制）

電穿孔，顯微注射，基因槍4本文檔共40頁；當前第4頁；編輯于星期二\12點24分DNA/磷酸鈣共沉淀法HPRT缺陷型的細胞DNA/磷酸鈣共沉淀為復合物，積累到細胞膜上，然后再由細胞攝取到內(nèi)部，并轉(zhuǎn)運到細胞核，DNA釋放并得到表達沉淀物要現(xiàn)用現(xiàn)配沉淀物必須包裹細胞，只適用于單層生長的細胞，而不適用懸浮或成團生長的細胞轉(zhuǎn)染效率低5本文檔共40頁；當前第5頁；編輯于星期二\12點24分6本文檔共40頁；當前第6頁；編輯于星期二\12點24分其他的化學轉(zhuǎn)染方法二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚陽離子糖類，可以促進DNA與胞吞相互作用瞬時轉(zhuǎn)染效率很高，但不能形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞系7本文檔共40頁；當前第7頁；編輯于星期二\12點24分脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofection(liposometransfection)將DNA包裝到一個磷脂泡囊中，泡囊可以與靶細胞的細胞膜相互作用，促進DNA攝取。適用于多種細胞類型，包括懸浮細胞可以轉(zhuǎn)染大片段DNA，比較溫和轉(zhuǎn)染效率高達90%可用于基因治療8本文檔共40頁；當前第8頁；編輯于星期二\12點24分9Lipofection本文檔共40頁；當前第9頁；編輯于星期二\12點24分10本文檔共40頁；當前第10頁；編輯于星期二\12點24分電穿孔法細胞置于短暫的電脈沖中使細胞膜上形成瞬時的納米大小的孔，DNA通過這些孔進入細胞并轉(zhuǎn)運到核。適用于多種類型的細胞確定電脈沖的強度和持續(xù)時間參數(shù)確定后，具有高重復性需要的細胞量比較大，容易引起死亡11本文檔共40頁；當前第11頁；編輯于星期二\12點24分單細胞轉(zhuǎn)染新技術(shù)：納米鋼筆探針電穿孔12本文檔共40頁；當前第12頁；編輯于星期二\12點24分直接轉(zhuǎn)化的方法顯微注射13本文檔共40頁；當前第13頁；編輯于星期二\12點24分14基因槍本文檔共40頁；當前第14頁；編輯于星期二\12點24分瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)入的DNA不能被細胞所整合，DNA在核中保持外源染色體狀態(tài)，也不包含在宿主細胞中可以發(fā)揮功能的復制起始位點，那么它只能保留很短的時間就會稀釋或者降解。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：DNA整合到基因組中，形成新的遺傳位點，并遺傳給所有的無性繁殖后代。15本文檔共40頁；當前第15頁；編輯于星期二\12點24分共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選動物細胞的選擇標記內(nèi)源選擇標記（依賴突變體）共轉(zhuǎn)染顯性選擇標記16本文檔共40頁；當前第16頁；編輯于星期二\12點24分TK可用作內(nèi)源選擇標記17本文檔共40頁；當前第17頁；編輯于星期二\12點24分常用的內(nèi)源選擇標記基因本文檔共40頁；當前第18頁；編輯于星期二\12點24分共轉(zhuǎn)染物理上不相連的DNA進行轉(zhuǎn)染，都會整合到基因組中。利用了解清楚的質(zhì)粒與目的基因共轉(zhuǎn)染，已知的篩選標記篩選，Southern鑒定目的基因。不相連的供體DNA片段在整合之前發(fā)生了融合。19本文檔共40頁；當前第19頁；編輯于星期二\12點24分顯性選擇標記內(nèi)源標記的缺陷：只能用于那些對應基因不具有功能的突變細胞系。顯性選擇標記所提供的表現(xiàn)型對于細胞來說是全新的，因此可以用于任何類型的細胞。20本文檔共40頁；當前第20頁；編輯于星期二\12點24分21本文檔共40頁；當前第21頁；編輯于星期二\12點24分選擇標記和轉(zhuǎn)化基因的擴增添加藥物篩選后，少數(shù)個別細胞會自發(fā)產(chǎn)生抗藥性突變而存活氨甲喋呤，DHFR，dhfr“假陽性”的去除：強啟動子驅(qū)動dhfr，引入第二個選擇標記22本文檔共40頁；當前第22頁；編輯于星期二\12點24分DNA介導的基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體23本文檔共40頁；當前第23頁；編輯于星期二\12點24分質(zhì)粒載體進行轉(zhuǎn)染的優(yōu)點質(zhì)粒載體的方便性得以在動物細胞中應用質(zhì)粒上的調(diào)控序列可以驅(qū)動目的基因的表達質(zhì)粒上的選擇標記和目的基因會一起整合到基因組，不需要與其他基因共轉(zhuǎn)染穿梭載體的使用，使載體保持為游離的復制子24本文檔共40頁；當前第24頁；編輯于星期二\12點24分用于瞬時轉(zhuǎn)化的非復制型質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)化時經(jīng)常使用質(zhì)粒載體目的就是利用染色體外DNA的短期存在性基因表達的瞬時測定和重組蛋白的適量回收在大多數(shù)動物細胞中共價閉合環(huán)狀DNA只能保持1~2天。25本文檔共40頁；當前第25頁；編輯于星期二\12點24分復制子載體的轉(zhuǎn)染失控的多瘤病毒復制子BK和BPV復制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化EBV復制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化26本文檔共40頁；當前第26頁；編輯于星期二\12點24分失控的多瘤病毒復制子多瘤病毒會造成溶解感染，即病毒基因組復制出非常高的拷貝數(shù)，從而使細胞裂解，釋放出成千上萬的子代病毒顆粒。利用其復制起點和啟動子構(gòu)建克隆載體，瞬時轉(zhuǎn)染，大量生產(chǎn)重組蛋白27本文檔共40頁；當前第27頁；編輯于星期二\12點24分SV40病毒載體SV40有約5kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組最初的SV40載體是病毒載體病毒外殼最大只能插入2.5kb的外源DNA28本文檔共40頁；當前第28頁；編輯于星期二\12點24分SV40質(zhì)粒載體攜帶有SV40復制起點的質(zhì)粒與病毒本身具有同樣的作用將SV40復制起點克隆到大腸桿菌載體上T抗原編碼區(qū)整合鼠多瘤病毒復制起始位點人巨細胞病毒啟動子29本文檔共40頁；當前第29頁；編輯于星期二\12點24分BK和BPV復制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BK病毒和EBV病毒會導致潛伏性感染，病毒基因組保持在低或中等的拷貝數(shù)，從而不會影響宿主細胞的生長。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率等于普通瞬時轉(zhuǎn)染的效率提供BKT抗原后，含有BK復制起點的質(zhì)粒載體就會像病毒一樣進行復制引入neo等選擇標記后，逐步提高培養(yǎng)基中抗生素的濃度，就可以篩選高拷貝的細胞30本文檔共40頁；當前第30頁；編輯于星期二\12點24分31本文檔共40頁；當前第31頁；編輯于星期二\12點24分BPV載體32本文檔共40頁；當前第32頁；編輯于星期二\12點24分EBP載體33本文檔共40頁；當前第33頁；編輯于星期二\12點24分腺病毒DNA病毒，基因組大約36kb6個早期轉(zhuǎn)錄子，1個主要的后期轉(zhuǎn)錄子穩(wěn)定性、外源DNA高容量、宿主范圍廣、高滴度后代34本文檔共40頁；當前第34頁；編輯于星期二\12點24分腺病毒相關(guān)載體AAV單鏈DNA病毒對異源輔助病毒有依賴性AAV載體已用于將基因高效轉(zhuǎn)入許多類型的細胞35本文檔共40頁；當前第35頁；編輯于星期二\12點24分桿狀病毒桿狀病毒具有桿狀的衣殼和大的dsDNA基因組感染許多節(jié)肢動物，特別是昆蟲。主要用于在昆蟲和昆蟲細胞內(nèi)的高水平瞬時蛋白表達AcMNPV和BmNPVsf9，sf21家蠶活體36本文檔共40頁；當前第36頁；編輯于星期二\12點24分37本文檔共40頁；當前第37頁；編輯于星期二\12點2