分光光度計知識匯總

分光光度計學(xué)問匯總擇性好等特點。通常所測樣品溶液濃度下限可達(dá)10-6~10-5mol/L，適用于測定食品中的微量組分〔如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等〕。一、原理物質(zhì)對光的選擇性吸取或透射。假設(shè)被照耀的是均勻溶液，光的散射可以無視。溶液顏色的產(chǎn)生當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸取，另一些波長的光則透過溶液。人把自身能感覺到的光定義為可見光。在可見光區(qū)，不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所打算。色。光吸取的本質(zhì)當(dāng)一束光照耀到某物質(zhì)或其溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)〔基態(tài)〕躍遷到較高能太〔激發(fā)態(tài)〕，這個作用稱為物質(zhì)對光的吸取。被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級，僅當(dāng)照耀光光子的能量hυ，與被照耀物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時，才能發(fā)生吸取。量差也不一樣。所以物質(zhì)對光的吸取具有選擇性。吸取曲線吸取曲線，也稱為吸取光譜，描述了物質(zhì)對不同波長的光的吸取力量?！布次舛取?，然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸取曲線。不同濃度的同一物質(zhì)，在吸取峰四周的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸取波長不變。假設(shè)在最大吸取波特長測定吸光度，則靈敏度最高。吸取曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。即朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光b的有色溶液時，溶質(zhì)吸取了光能，光的強(qiáng)度就要減弱。多，光強(qiáng)度的減弱也越顯著。A=lg(I/I0)=εbcA-吸光度；I0-cd；I-cd；ε-L/(mol˙cm)；液層厚度〔光程長度〕，cm；mol/L。其物理意義為：當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。1mol/L1cm光程中的吸光度。εε值越大，方法的靈敏度越高。ε時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數(shù)。等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。TII之比，即：0T=I/I0A=lg(1/T)二、主要部件源、單色器、吸取池和檢測系統(tǒng)。光源的光強(qiáng)度，并在肯定時間內(nèi)能保持穩(wěn)定。320~2500nm之間的連續(xù)光譜。鎢絲燈工作溫度一般為3680K。很大變化，因此必需使用穩(wěn)壓電源。在紫外區(qū)測量時，常承受產(chǎn)生波長在180~375nm之間的連續(xù)光譜作為光源。隨波長變化能量變化不大，但在實際上難以實現(xiàn)。氘燈輻射強(qiáng)度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強(qiáng)度一般高于氫燈，但欠穩(wěn)定，波長范圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發(fā)光源。單色器單色器是將光源放射的復(fù)合光分解為單色光的裝置。〔一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束〕、色散器、投影器〔一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫〕、出光狹縫。色散器是單色器的核心局部，常用的色散元件是棱鏡或光柵。棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散力量強(qiáng)，但吸取紫外光，只能用于350820nm石英棱鏡。光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便于自動化，工作波段廣。吸取池也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個相互平行、透光且具有準(zhǔn)確厚度的平面。玻璃吸取池光程長度一般為1cm0.110cm的。由于吸取池厚度存在肯定誤差，其材質(zhì)對光不是完全透亮，在做定量分析時，對吸取池應(yīng)做配套性試驗，試驗后標(biāo)記出放置方向。紫外光區(qū)數(shù)值不跳為石英。檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)包括檢測器和記錄顯示裝置。檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栵@示出來。常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲乏效應(yīng)嚴(yán)峻。光電倍增管利用二次電子放射來放大光電流，放大倍數(shù)可高達(dá)108倍，應(yīng)用最為廣泛。光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內(nèi)波長范圍的掃描。記錄顯示裝置包括放大器和結(jié)果顯示裝置。70年月承受數(shù)字讀出裝置。量數(shù)據(jù)，裝有屏幕顯示、打印機(jī)和繪圖儀等。三、測量條件的選擇顯色反響及顯色條件的選擇進(jìn)展比色或光度測定。合物的試劑稱為顯色劑。顯色反響的選擇反響。選用的原則是：1〕選擇靈敏的顯色反響。摩爾吸光系數(shù)ε的大小是顯色反響靈敏度凹凸的重要標(biāo)志，因此應(yīng)中選擇生成的有色物質(zhì)的ε較大的顯色反響。一般來說，當(dāng)ε為104105時，可認(rèn)為該反響靈敏度較高。2〕盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數(shù)幾個組分發(fā)生顯色反響。顯色劑在測定波特長無明顯吸取。通常把兩種有色物質(zhì)最大吸取波長之差稱為比照度，一般要求顯色劑與有色化合物的比照度在60nm以上。反響生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。顯色條件的選擇件，使顯色反響完全和穩(wěn)定。1〕依據(jù)溶液平衡原理，有色絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)越大，顯色劑過量越多，反響，對測定反而不利。2〕酸度對顯色反響的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反響的適宜酸度范圍是通過試驗來確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度，轉(zhuǎn)變?nèi)芤簆H值，測定其吸光度，作出吸光度-pH值關(guān)系曲線，選擇pH值作為測定條件。顯色反響一般在室溫下進(jìn)展，有的反響需要加熱，以加速顯色反響，使之進(jìn)展完全。大多數(shù)顯色反響需要經(jīng)過肯定的時間才能完成，其長短與溫度的凹凸通過試驗作出在肯定溫度下的吸光度-時間關(guān)系曲線，得到適宜的顯色時間。干擾的消退干擾的類型都將干擾測定。干擾離子本身有顏色干擾離子本身無顏色，但能與顯色劑反響生成穩(wěn)定的協(xié)作物。假設(shè)生成的度，影響被測離子與顯色劑的反響，而產(chǎn)生誤差。干擾離子與被測離子反響生成協(xié)作物或沉淀，影響被測離子的測定。A.掌握溶液酸度。B.參加掩蔽劑與干擾離子形成更穩(wěn)定的化合物，使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。C.里用參比溶液消退某些有色干擾離子的影響。D.選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞑ㄩL以消退干擾。E.承受適當(dāng)?shù)姆謩e方法。吸光度測量條件的選擇入射光波長的選擇應(yīng)依據(jù)吸取光譜曲線，選擇溶液具有最大吸取時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡(luò)合物在420nm波特長均有最大吸取峰。如用此波長測定鈷，則未反響的顯色劑會造成干擾而降低測定的準(zhǔn)確度。因此必需選擇在500nm波特長測定，在此波長下顯色劑不發(fā)生吸取。而鈷絡(luò)合物則有一吸取平臺。參比溶液的選擇1〕假設(shè)僅待測物與顯色劑的反響產(chǎn)物有吸取，可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸?〕假設(shè)顯色劑或其他試劑略有吸取，應(yīng)用空白溶液〔不加試樣的溶液〕作參比溶液。如試樣中其他組分有吸取，但不與顯色劑反響，則當(dāng)顯色劑無吸取當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。吸光度讀數(shù)范圍的選擇實踐證明，吸光度在0.20.5 內(nèi)時，測量的相對誤差最小?？捎脙煞N方法來調(diào)整被測溶液的吸光度：掌握被測溶液的濃度。如轉(zhuǎn)變?nèi)恿浚D(zhuǎn)變?nèi)芤旱臐饪s倍數(shù)或稀釋倍數(shù)。的溶液要用光程短的比色皿。四、應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域高含量組分測定-示差法當(dāng)待測組分含量較高時，測得的吸光度值常常偏離朗伯-比爾定律?！惨话愎舛确ā?，使測得的吸光度太高，超出適宜的讀數(shù)范圍而引入較大的誤差。承受示差法就能抑制這一缺點。但應(yīng)用示差法時，要求儀器光源有足夠的放射強(qiáng)度或能增大光電流放大倍數(shù)，以便能調(diào)整參比溶液透光度為100。這就要求儀器單色器質(zhì)量高，電光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性好。多組分分析一個以上組分。假定溶液中同時存在兩種組分xy，其吸取光譜一般有重疊和不重疊兩種狀況。不重疊的測定組分相互不產(chǎn)生干擾。λ1λ2時分別測定吸光度A1A2，由吸光度值的加和性得到聯(lián)立方程，通過解聯(lián)立方程求得各濃度值。定量方法種標(biāo)準(zhǔn)曲線法的方法。依據(jù)光吸取定律，對于一種有色化合物，ε是一個定值，假設(shè)把光程L也固定，那么吸光度A就和溶液的濃度c成正比，也就是說吸光度A和濃度c呈線性關(guān)系。配制一系列適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后分別測定其吸光度，把吸光度 A對濃度c作圖，即得工作曲線。直接比較法直接比較法其實質(zhì)也是工作曲線法，是一種簡化的工作曲線法。配一個被測組分濃度為cs的標(biāo)樣，測其吸光度為As，在同樣條件下再測未知樣品的吸光度為Ax，通過計算可求出未知樣品的濃度cx。A=εcLs sA=εcLx x由于溶液性質(zhì)一樣，比色皿厚度一樣，所以As/Ax=cs/cx式中：cmol/L；sc-mol/L；xA-被測組分的吸光度；sA-未知樣品的吸光度。x直接比較法簡化了繪制工作曲線的步驟，適用于個別樣品的測定。差。標(biāo)準(zhǔn)參加法標(biāo)準(zhǔn)參加法是工作曲線的一種特別應(yīng)用。選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件，先測定濃度為cx的未知樣品吸光度為Ax，再向未知樣品中參加肯定量的標(biāo)樣，配置成濃度為cx+Δc1cx+Δc2…一系列樣品，分別顯色后再測定吸光度為A1、A2…最終在坐標(biāo)紙上繪圖，以吸A為縱坐標(biāo)，以濃度c為橫坐標(biāo)，分別畫出Δc1、Δc2A1、A2等各點，連成直線后延長，與橫軸的交點cx也就是未知樣品的濃度cs。當(dāng)角度，濃度過大或過小都會帶來測量誤差。，干擾因素較多而又不太清楚的樣品，由于它能消退背景的影響。紫外可見分光光度計使用中的留意點保護(hù)光源關(guān)燈。一旦停機(jī)，則要待燈冷卻后再重啟動，并預(yù)熱15min。燈泡發(fā)黑或亮度明顯減弱或不穩(wěn)定時，就準(zhǔn)時更換。經(jīng)經(jīng)紫外光照耀后形成結(jié)痕可用無水乙醇去除。保證適宜的工作環(huán)境溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。引起儀器機(jī)械局部的誤差或性能下降；光、噪聲等；維護(hù)保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正溫度和濕度。恒溫設(shè)備。環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也可以影響機(jī)械系統(tǒng)的敏捷性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電耦合器的牢靠性，也是造成光學(xué)部件鋁膜銹蝕的緣由之一。因此必需定期清潔，保障環(huán)境和儀器內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。定期除塵、調(diào)校儀器使用肯定時間后，內(nèi)部會積存肯定量的塵埃，最好由修理工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)展除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)展清潔，必要時對光路進(jìn)展校的檢測、調(diào)校和記錄。正確使用比色皿以免沾污。清洗比色皿時，先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。假設(shè)被比色皿