新型亞甲基四氫葉酸還原酶單核苷酸多態(tài)性研究方法檢測惡性血液病易感性

新型亞甲基四氫葉酸還原酶單核苷酸多態(tài)性研究方法檢測惡性血液病易感性【摘要】本研究探討一種新型亞甲基四氫葉酸還原酶單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測方法，并用其檢測惡性血液病遺傳易感性。根據(jù)cDNA芯片原理制作一種目的基因芯片，利用雙色熒光探針雜交進行SNP位點檢測，測序法對該芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進行驗證,并以此對來自中國江蘇地區(qū)的157例健康對照和127例惡性血液病患者(30例多發(fā)性骨髓瘤，28例非霍奇金淋巴瘤，22例急性淋巴細胞白血病，40例急性髓系白血病，7例慢性髓系白血病)的MTHFR基因C677T多態(tài)位點進行檢測。結(jié)果表明，為野生型、雜合型和突變型的疊加熒光分別顯示為綠色、黃色和紅色。測序結(jié)果與芯片結(jié)果吻合。677C和677T在病例和對照組的基因頻率分別為%、%、%和%，差異有顯著性。677TT基因型發(fā)生MM相對風(fēng)險明顯增加。結(jié)論：本芯片檢測方法準(zhǔn)確、高通量且價格低廉，適用于大規(guī)模樣本SNP調(diào)查；C677T多態(tài)改變影響惡性血液病的發(fā)病風(fēng)險。677TT基因型是MM的易感因素。

【關(guān)鍵詞】單核苷酸多態(tài)性；基因芯片；雙色熒光雜交；亞甲基四氫葉酸還原酶；惡性血液病

ANewMethodfor5,10-MethylenetetrahydrofolateReductaseSingleNucleotidePolymorphismsGenotypingUsedtoStudySusceptibilityofHematologicalMalignancy

AbstractTheaimofthisstudywastosetupanewmethodfor5,10-Methylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)singlenucleotidepolymorphisms(SNP)genotyping,andtoinvestigatethehereditarysusceptibilityofhematologicalmalignancy.PreparedanaimedgenemicroarraybasedoncDNAmicroarraytheory,dual-colorfluorescenecehybri-dizationwasusedtodetectSNPloci,andDNAsequencingwasperformedtoconfirmtheresults.TheMTHFRC677TSNPlociof157controlsand127patientswithhematologicalmalignancies(30multiplemyeloma,28non-Hodgkin′slymphoma,22acutelymphoblasticleukemia,40acutemyeloidleukemia,7chronicmyeloidleukemia)fromJiangsuprovinceweredetected.Theresultsshowedthatafteroverlapping,homozygouswildtype,heterozygotetypeandhomozygousmutanttypeyieldedgreen,yellowandredfluorescence,respectively.DNAsequencingvalidatedtheseresults.Theallelefrequencyof677Cand677Tinpatientsandcontrolswere%and%,%and%respectively,showingstatisticallysignificantdifference(χ2=,P=).677TTgenotypeshowedasignificantlyhigherriskofMM(OR=;95%CI=;P=).Itisconcludedthatthismicroarray-basedmethodisaccurate,high-throughputandinexpensive,suitableforSNPgenotypinginalargenumbeerofindividuals.C677Tpolymorphismsinfluencetheriskofhematologicalmalignancies.677TTgenotypeissusceptivetoMM.

Keywordssinglenucleotidepolymorphism;genemicroarray;dual-colorfluorescenecehybridization;5,10-methylenetetrahydrofolatereductase;hematologicalmalignancy

染色體DNA序列的某個位點上存在的單個堿基變化如果在人群中的發(fā)生頻率超過1%，即為單核苷酸多態(tài)性。表達基因平均每1000bp即出現(xiàn)一個SNP位點，是人類基因組序列變異的主要形式。在不同的人群中，SNP的頻率分布有差異，這些差異可以代表某一種族或人群間的遺傳差異。研究SNP有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復(fù)雜疾病的易感性，以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)性。因此，有必要建立一種準(zhǔn)確、費用低、適合大樣本的SNP檢測方法。近年來研究表明，葉酸缺乏和葉酸代謝異?？蓪?dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其基因C677T位點多態(tài)改變引起酶活性下降，已被證實它與多種腫瘤的易感性有關(guān)。為此我們建立一種芯片檢測方法，并對惡性血液病患者的C677T位點進行初步分析。

材料和方法

研究對象

127例病例樣本取自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院2004年1月至2004年11月收治的血液腫瘤患者。在127例病例中多發(fā)性骨髓瘤30例，非霍奇金淋巴瘤28例，急性淋巴細胞白血病22例，急性髓系白血病40例，慢性髓系白血病7例。所有MM經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學(xué)、血或尿M蛋白、本-周氏蛋白檢測及扁骨X光片確診，NHL經(jīng)組織病理確診，白血病患者經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)確診，所有患者排除已行異基因造血干細胞移植。157例健康對照樣本取自同期在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院健康查體人群，對照人群排除惡性腫瘤、冠心病。所有標(biāo)本均為EDTA抗凝的外周血。病例組男76人，女51人，年齡18-79歲，平均年齡歲；對照組男98人，女59人，年齡22-75歲，平均年齡歲。兩組性別、年齡分布無顯著差異。常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA。

目的片段的PCR擴增和純化

采用已報道的引物序列［1］，C677T位點的PCR反應(yīng)體系為30μl，其中含10×的緩沖液3μl，25mmol/L的Mg2+溶液2μl，10mmol/L的dNTPμl，10μmol/L的雙側(cè)引物各1μl，U的TaqDNA聚合酶，提取的基因組DNA1μl。擴增條件：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，72℃延伸7分鐘。擴增在GeneAmp2400PCRSystem上進行。QIAquickPCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。分光光度計對PCR產(chǎn)物進行定量并將產(chǎn)物溶于3×SSC緩沖液中，濃度為300ng/μl。

目的片段芯片的制備及雜交

將PCR產(chǎn)物通過PixSys5500點樣儀點于氨基玻片上。點樣后玻片水化30分鐘，100℃快干2秒，400mJ紫外交聯(lián)，80℃干烤2小時。野生型探針677CC：5′-Cy3-CGGGAGCCGATTT-3′，突變型探針677TT：5′-Cy3-CGGGAGTCGATTT-3′。將熒光標(biāo)記探針1μmol/L與雜交液按體積1∶3混合。在潮濕的雜交盒中37℃雜交2小時。室溫下分別用2×SSC-%SDS和×SSC-%SDS清洗5分鐘，滅菌雙蒸水清洗2分鐘后吹干玻片。用ScanArrayLite微陣列分析系統(tǒng)進行芯片掃描。

統(tǒng)計學(xué)處理

病例組和對照組的MTHFR基因型的頻率差異以χ2檢驗確定，為差異有顯著意義。惡性血液病和MTHFR基因多態(tài)性的相關(guān)性用比值比以及95％的可信度表示，OR值經(jīng)過年齡、性別校正。所有統(tǒng)計分析均用SPSS軟件計算。

結(jié)果

樣品微陣列的分析

雙色熒光雜交進行SNP分型原理為經(jīng)過雜交掃描后，野生型樣本能獲得一個較強的Cy3熒光，突變型樣本獲得一個較強的Cy5熒光，雜合型樣本既可獲得Cy3熒光又可獲得Cy5熒光，經(jīng)過疊加后能顯示一個較強的“黃色”熒光。我們分析了惡性血液病的6個樣本的C677T位點。附圖A、B和C中顯示了6個樣品的熒光信號和附圖D中顯示了這些樣品的熒光信號的強度值。從圖中可以看到4個樣品顯示了較強的Cy3熒光信號，并且顯示了和背景接近的Cy5熒光值，Cy5/Cy3的比值在和之間，表明這4個樣品的DNA僅僅與檢測子677CC相匹配，因此判斷它們在C677T位點為純合野生型。樣品5顯示了“紅色”的熒光，Cy5/Cy3的比值是，因此可以判斷這個樣品在C677T位點為純合變異型。樣品6分別得到了較強的Cy3和Cy5熒光信號，Cy5/Cy3的比值是，因此可以判斷這個樣品在C677T位點為雜合型。我們對上述6個樣品進行了測序驗證，測序結(jié)果和芯片結(jié)果相一致。

雙色熒光雜交微陣列的高通量應(yīng)用

我們利用雙色雜交微陣列芯片技術(shù)對127例惡性血液病患者和157例健康對照的MTHFR基因的C677T位點進行了分析。兩組樣本分別點制了4個微陣列，每個微陣列中同一樣本重復(fù)3個點，病例組點制的微陣列大小為18×22，其中第22行僅有1個樣本，對照組點制的微陣列大小為21×23，第23行有3個樣本。所有樣本PCR產(chǎn)物的點樣濃度控制在200-300ng/μl之間。根據(jù)Cy3和Cy5雙色熒光掃描結(jié)果疊加圖所呈現(xiàn)的綠、紅、黃3種顏色進行分型。同一樣本在同一微陣列中有很好的重復(fù)性，在不同微陣列中熒光強度略有差別，但疊加圖顏色一致，分型結(jié)果一致。兩組基因型頻率均符合Hardy-Wenberg平衡，樣本具有群體代表性。病例組的C和T基因頻率為%和%，對照組的C和T基因頻率為%和%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們對兩組的MTHFRC677T基因型及惡性血液病的易感性進行了單因素分析，677CC、677CT和677TT在患者組和對照組分別為48例、53例(%)、26例(%)和72例、66例(%)、19例(%)。發(fā)現(xiàn)677CT和677TT基因型相對677CC基因型發(fā)生惡性血液病的風(fēng)險度有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進而我們將患者組4種疾病分別與對照組進行了單因素分析，發(fā)現(xiàn)677TT基因型發(fā)生MM的風(fēng)險明顯增加。677CT和677TT基因型的NHL易感程度有增加的趨勢，且677TT較677CT增加明顯，呈等位基因計量-效應(yīng)關(guān)系。相反，677TT基因型的ALL易感程度有下降趨勢。Table1.CorrelationbetweenMTHFRC667TandriskofMMandNHL

Table2.CorrelationbetweenMTHFRC667TandriskofALLandAML

討論

近年來SNP芯片檢測備受關(guān)注。目前芯片的制作主要有兩種方法，一種是將探針固定于芯片，將PCR擴增并標(biāo)記的待檢測目的DNA混合物與探針雜交，這種方法可以檢測有限樣本的多個SNP位點；另一種方法是將PCR擴增后的待檢測目的DNA固定于芯片，以標(biāo)記的探針進行雜交，這種方法可以檢測多個樣本的有限SNP位點。Flavell等［2］研制了基于后一種方法的SNP檢測芯片，但該方法昂貴的鏈霉抗生物素蛋白修飾的玻片只能在PBS中保存3天。我們介紹的雙色熒光雜交微陣列方法在等位基因的區(qū)分上過程簡單、自動化程度高，大樣本檢測時成本相對低，能在一個實驗中分析上千個樣品，因此節(jié)省了時間和增強了效率。測序法證明，含有13個堿基的熒光標(biāo)記檢測子在37℃的雜交溫度下能夠精確地進行基因分型。而且該芯片能夠較長時間地儲存，實驗中能夠使用較多的微陣列，因此它能對結(jié)果的分析提供一個較好的統(tǒng)計基礎(chǔ)。葉酸缺乏和(或)葉酸代謝異?？蓪?dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生，這與葉酸的兩種主要作用有關(guān)：①提供甲基使dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP，參與DNA的合成；②作為甲基供體維持基因組甲基化的獨特模式。MTHFR通過影響葉酸代謝而與腫瘤易感相關(guān)。無論何種基因型導(dǎo)致何種疾病易感，增加葉酸攝入似乎都可以降低發(fā)病的危險性。但許多疾病的發(fā)生與父母甚至祖父母的葉酸缺乏有關(guān)，提高個體葉酸水平從而達到預(yù)防疾病的目的似乎也需要長期的過程；且由于基因型的不同，個體對葉酸的需求量有差異。因此鑒別遺傳易感個體進行目標(biāo)明確的預(yù)防十分重要。患者組和對照組677C和677T基因頻率的顯著性差異提示C677T多態(tài)改變影響惡性血液病的發(fā)病風(fēng)險。具體疾病分析提示,該位點變異在各種惡性血液病的易感性及易感程度上不完全相同。Gonzalez-Ordonez等［3］發(fā)現(xiàn)，MM患者組的677CC基因型明顯少于對照組，其中15例IgG型MM中僅有1例為677CC，677CC可以使MM發(fā)病風(fēng)險下降75%，Gonzalez-Fraile等［4］的研究數(shù)據(jù)也顯示MTHFR677CC在MM患者組和對照組中的分布頻率明顯不同，這與我們的研究結(jié)果一致。雖然我們的樣本數(shù)較少，但677TT基因型比例在兩組中差異顯著，難以完全用抽樣誤差解釋。多數(shù)研究認為677CT/TT對ALL有保護作用，但最近一項在意大利人群中的研究顯示C677T與ALL發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，認為這可能是該地區(qū)人群的677T基因頻率過高以及高葉酸攝入水平造成的［5］。我們的研究也得出C677T與ALL發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，在我們的對照組中677T基因頻率為%，與上海地區(qū)人群的基因頻率相似［6］，明顯低于中國北方人群［7］以及上述意大利人群，這不足以解釋該結(jié)果。同時我們的數(shù)據(jù)顯示677TT的ALL發(fā)病風(fēng)險有下降趨勢，與大多數(shù)的研究結(jié)論一致，但獲得能反映真實情況的結(jié)果可能還需要擴大樣本含量。C677T與AML發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，這與目前所有AML的研究結(jié)果一致。NHL發(fā)病風(fēng)險與C677T沒有明顯相關(guān)，這符合高加索人種間的研究結(jié)果［8］；但降低的酶活性似乎使患病趨勢增加，這與Skibola等［9］報道的677TT基因型的個體發(fā)生濾泡淋巴瘤的相對風(fēng)險度升高存在一致性。相反，對日本人群的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)677T發(fā)生NHL的風(fēng)險下降［10］。不盡相同的研究結(jié)果說明MTHFRC677T與疾病易感性關(guān)系可能因地區(qū)人群的基因頻率而異，因生活習(xí)慣而異，或者還受某些相關(guān)基因多態(tài)的影響。因此要取得反應(yīng)真實情況的研究結(jié)果可能需要更大的樣本含量，精確的疾病分型，合理的對照，多因素的分析。我們將在MTHFRSNP與惡性血液病遺傳易感性的后續(xù)研究中加以完善，而雙色熒光雜交微陣列方法將為我們的研究提供高通量平臺。

【參考文獻】

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6張國棟,項坤三,翁青等.亞甲基四氫葉酸還原酶C677T多態(tài)性與上