微生物工程下游工程簡介

一、微生物工程下游工程概論本文檔共63頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分1、微生物工程下游工程的特點(diǎn)

1）發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)2）所需產(chǎn)物在培養(yǎng)液中濃度較低3）普遍存在下游工程代價(jià)高，回收率較低等問題本文檔共63頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、微生物工程下游工程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術(shù)加速固、液分離；如產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還要進(jìn)行細(xì)胞破碎提取（初步純化）目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)差異大的雜質(zhì)精制（高度純化）是采用對產(chǎn)品有高度選擇性的分離技術(shù)，除去與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)相近的雜質(zhì)最終獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品本文檔共63頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分3、主要操作單元：絮凝離心過濾細(xì)胞破碎萃取沉淀層析結(jié)晶干燥本文檔共63頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二、發(fā)酵液預(yù)處理和過濾本文檔共63頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分一）發(fā)酵液的預(yù)處理1、目的：發(fā)酵液中雜質(zhì)多且成分復(fù)雜，其中對純化影響最大的是高價(jià)無機(jī)離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等

改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處理的相中；能夠除去部分雜質(zhì)。本文檔共63頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、高價(jià)無機(jī)離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時，可用草酸鈉取代；草酸價(jià)格較高，生產(chǎn)上一般需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子形成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+本文檔共63頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分3、可溶性雜蛋白的去除

雜蛋白的存在會降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會發(fā)生乳化，影響兩相分離。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時，還會使濾速下降，使膜受到污染。本文檔共63頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分1）沉淀法

調(diào)等電點(diǎn)

因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍(pH4.0-5.5)

但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形成沉淀2）變性法

變性蛋白溶解度較小

最常用加熱法

加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；

其他方法：

大幅度調(diào)節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑

變性法存在一定的局限

如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿，而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。3）吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去

如四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去本文檔共63頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二）發(fā)酵液的過濾1、質(zhì)量比阻力（rB）——單位濾餅厚度的阻力系數(shù)；與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，衡量過濾特性的主要指標(biāo)。對于不可壓縮濾餅，比阻力值是常數(shù)；對于可壓縮性濾餅，比阻力是操作壓力差的函數(shù)rB=r(⊿P)mr——不可壓縮濾餅的比阻（對一定料液其值為常數(shù)）；m——壓縮性指數(shù)，一般為0.5-0.8；不可壓縮濾餅為0；⊿P——壓力差本文檔共63頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分

發(fā)酵液多為非牛頓流體，濾渣為可壓縮性的；

發(fā)酵液濾餅的比阻與一般可壓縮濾餅相比，有其特殊性。一般可壓縮濾餅的比阻是操作壓力差的函數(shù)，在不變的壓差之下，濾餅比阻力是一定值，即在不變壓差下過濾時，過濾速度的逐漸下降是由于濾餅厚度的逐漸增加所致，而作為單位濾餅厚度的過濾阻力即濾餅比阻力是不變的；但發(fā)酵液濾餅，即使在恒定的操作壓差下，當(dāng)濾餅中所含固形物濃度達(dá)到某一界限值時，濾餅的比阻力就不是一定值，而會突然升高，因此過濾速度不但隨濾餅厚度的增加而下降，還會因?yàn)V餅比阻力的突然升高而額外下降。這是由于有機(jī)物質(zhì)的膠體粒子借靜電吸引而結(jié)合的水分子所致；對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，可以降低結(jié)合水的比率，使發(fā)酵液濾餅更接近一般可壓縮性濾餅的性質(zhì)。本文檔共63頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、常用過濾設(shè)備1）板框(plateandframe)壓濾機(jī)板框過濾機(jī)結(jié)構(gòu)圖

（曹軍衛(wèi)320頁）1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓裝置2）帶式壓濾機(jī)本文檔共63頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)行補(bǔ)料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度；菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物增加發(fā)酵液黏度3、影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細(xì)胞體積真菌菌絲體較粗大，質(zhì)量比阻小，發(fā)酵液不需經(jīng)特殊處理就很容易過濾；放線菌菌絲細(xì)而分支，交織成網(wǎng)格狀，質(zhì)量比阻力大，較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處理，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，提高過濾速度；細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處理，很難用常規(guī)過濾設(shè)備進(jìn)行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會增加過濾難度3）放罐時機(jī)本文檔共63頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時，會使發(fā)酵液的黏度增大而影響過濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。4、提高過濾性能的方法1）加助濾劑

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；

常用硅藻土、珍珠巖等；

加入方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3）酶解法本文檔共63頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三）細(xì)胞破碎目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)胞內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)形成的包含體是不分泌的，故需進(jìn)行細(xì)胞破碎。本文檔共63頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法；利用高壓使細(xì)胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)，造成細(xì)胞破碎。影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)1、細(xì)胞破碎方法1）高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2）高速球磨法高速球磨機(jī)1-物料進(jìn)口2-物料出口3、4-冷卻水進(jìn)、出口5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細(xì)胞得以破碎。3）超聲波法常用超聲波頻率15-25kHz；細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，由于這種空穴泡又受到超聲波的迅速沖擊而閉合，從而產(chǎn)生極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由此引起的黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，造成細(xì)胞破碎；超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作是需冷卻；通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4）酶解法

專一性強(qiáng)，條件溫和；但費(fèi)用較高

酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用即溶胞的酶是微生物自身產(chǎn)生的；大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解自身細(xì)胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶；當(dāng)改變一定的環(huán)境條件時，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶現(xiàn)象。5）滲透壓沖擊法

將細(xì)胞先放入高滲透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在達(dá)到平衡后，介質(zhì)突然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，水就會迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂；此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理的，或細(xì)胞壁合成受到抑制的微生物；6）反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞反復(fù)在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞本文檔共63頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、細(xì)胞破碎率測定當(dāng)細(xì)胞內(nèi)含物釋放到水相時，會引起導(dǎo)電率的變化；隨破碎率的增加而增加，有線性關(guān)系；

因?qū)щ娐实淖x數(shù)取決于微生物的種類、處理?xiàng)l件、細(xì)胞濃度等，應(yīng)先用其他方法標(biāo)準(zhǔn)化1）直接測定法觀察計(jì)數(shù)（必要時配合染色技術(shù)）2）測定釋放的蛋白或酶活力3）測定導(dǎo)電率本文檔共63頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三、沉淀法（Precipitation）本文檔共63頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。方法簡單、成本低、使用廣泛，一般作為初步分離的手段；鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法生成鹽復(fù)合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法本文檔共63頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分

中性鹽的加入能破壞蛋白、酶等的膠體性質(zhì)，中和微粒上的電荷，促使蛋白質(zhì)等沉淀。一）鹽析法(Saltingout)本文檔共63頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分1、鹽析原理——Cohn方程蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度間的關(guān)系可用Cohn方程式表示：logS/S0=－Ks·I

S—離子強(qiáng)度為I時的蛋白溶解度(g/L);S0—純?nèi)軇碔=0）時蛋白的溶解度；Ks—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無關(guān)；I—離子強(qiáng)度本文檔共63頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分鹽析法分離蛋白質(zhì)時，可分兩類：1）在一定的pH值和溫度下，改變離子強(qiáng)度或鹽濃度的沉淀方法——“K”分級鹽析法2）在一定離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度的沉淀方法——“”分級鹽析法當(dāng)溫度一定時，S0對于某一溶質(zhì)是一常數(shù)，即logS0=是溶質(zhì)的特征常數(shù)，對于蛋白質(zhì)而言，其大小主要取決于不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，它也與溶液的溫度和pH值有關(guān)，但與鹽的種類無關(guān)。本文檔共63頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、影響鹽析的主要因素鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象（比在純水中的溶解度大大增加）；高鹽濃度則鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；鹽析劑種類很多，不同種類的鹽對蛋白溶解度的影響是不同的；離子半徑小且電荷高的離子對鹽析作用的影響較強(qiáng)，離子半徑較大而電荷低的離子影響較弱；不同種類的鹽對溶解度的影響，主要是對Ks值的影響，，Ks值越大，該鹽的鹽析效果越好。1）蛋白質(zhì)濃度

高濃度的蛋白溶液，可減少鹽的用量；但共沉現(xiàn)象嚴(yán)重用低濃度蛋白溶液進(jìn)行鹽析，需用較多的鹽，共沉作用較輕2）離子強(qiáng)度和種類3）溫度溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在水化時要吸熱，失水時則放熱；溫度升高有利于蛋白質(zhì)失水沉淀。4）pH值除與蛋白質(zhì)和溫度有關(guān)外，還與pH有關(guān)；鹽析pH的選擇要以不降低產(chǎn)物的活性為原則；由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH本文檔共63頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二）等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在電中性時溶解度最低優(yōu)點(diǎn)：許多蛋白的等電點(diǎn)都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無機(jī)酸的價(jià)格低廉，并能為食品標(biāo)準(zhǔn)允許；缺點(diǎn)：酸化時易引起蛋白失活

不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會發(fā)生等電點(diǎn)偏移，如胰島素的等電點(diǎn)為5.3，在與Zn2+結(jié)合形成胰島素鋅鹽，其等電點(diǎn)升為6.2；故加入金屬離子后選擇等電點(diǎn)沉淀時，要注意調(diào)整pH。本文檔共63頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三）有機(jī)溶劑沉淀法許多有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生沉淀作用。這種沉淀作用是多種效應(yīng)的結(jié)果，但主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時，水對蛋白等分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸引力增大，帶電溶質(zhì)互相吸引而聚集。對于具有表面水層的生物分子，有機(jī)溶劑與水的作用，使這些分子表面水層厚度不斷壓縮，最后使這些分子脫水而相互聚集析出。不同濃度的有機(jī)溶劑可使不同的溶質(zhì)沉淀，即分步沉淀法，達(dá)到分離純化的目的。1、原理本文檔共63頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

分辨能力較高，一種溶質(zhì)只在一個比較窄的有機(jī)溶劑范圍內(nèi)沉淀；沉淀無需脫鹽；有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，易進(jìn)行固液分離；有機(jī)溶劑易揮發(fā)，不會在成品中殘留。缺點(diǎn)：

易引起蛋白變性；易燃、易爆本文檔共63頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分用于生物物質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑須能與水互溶，但對蛋白無作用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)最常用的沉淀劑；在沉淀過程中，乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高，這對熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大（少量多次、攪拌）3、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素1）有機(jī)溶劑的種類2）溫度多數(shù)生物物質(zhì)在有機(jī)溶劑與水的混合液中的溶解度是隨溫度的降低而降低的，因此降低溫度可增加收率；低溫沉淀還能更好地保護(hù)生物物質(zhì)的活性3）pH在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍內(nèi)，選擇溶解度最低時的pH，有助于提高沉淀效果；在接近等電點(diǎn)處，引起沉淀所需有機(jī)溶劑的量最??；合適的pH還可大大提高分離的分辨能力4）樣品濃度和分子質(zhì)量低濃度樣品需要使用有機(jī)溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低；高濃度樣品使用有機(jī)溶劑的量較小，減少了變性的危險(xiǎn)；但共沉作用大，分離效果較差。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。5）金屬離子和離子強(qiáng)度Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等離子能與蛋白質(zhì)的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合；Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能與羧基結(jié)合；Ag+、Hg2+、Pb2+能與巰基結(jié)合形成復(fù)合物；某些有機(jī)化合物能與生物大分子形成難容的復(fù)合物.這類復(fù)合物在水或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的生物活性，同時還能降低有機(jī)溶劑的用量。本文檔共63頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分四）非離子型多聚物沉淀法聚乙二醇(PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸鈉等沉淀效能高；操作條件溫和，不易引起生物大分子變性；沉淀后易除去；無毒、不可燃；廣泛用于核酸、蛋白等的分離純化。機(jī)制：可能降低生物大分子水化度，與大分子發(fā)生共沉作用；與生物大分子形成復(fù)合物；或通過空間位置排斥，使液體中的微粒被迫聚集而沉淀。常用PEG6000-20000；PEG的沉淀效果除與沉淀劑的濃度有關(guān)外，還受離子強(qiáng)度、pH和溫度的影響本文檔共63頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分離子型的多糖化合物：

酸性多糖用的較多，如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、果膠酸鹽、卡拉膠等陰離子聚合物：如聚丙烯酸陽離子聚合物：如聚乙烯亞胺等

可沉淀蛋白，作用方式類似于絮凝劑，兼有一定的鹽析和水化作用五）聚電解質(zhì)沉淀法本文檔共63頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分四、溶劑萃取法(Solventextraction)本文檔共63頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分一）溶劑萃取原理——分配定律

溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的，即利用各種物質(zhì)在不同溶劑中具有不同的溶解度的原理，達(dá)到將不同物質(zhì)分離純化的目的。分配定律（distributionlaw;Nester,1891）——在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩不相溶的溶劑中，達(dá)到平衡時，溶質(zhì)在兩相的濃度之比為一常數(shù)。

K=CL/CR=萃取液濃度/萃余液濃度K為分配常數(shù)（分配系數(shù)、分配比），其大小反映出溶質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異，及在此系統(tǒng)中的選擇性

在溶劑萃取中，含有溶質(zhì)的未被提取過的溶液稱為料液；用于進(jìn)行萃取的溶劑稱為萃取劑；經(jīng)萃取后含有溶質(zhì)的萃取劑稱為萃取液；被萃取過失去溶質(zhì)的料液稱為萃余液。本文檔共63頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分分離因素（分離系數(shù)）

若在同一體系中有兩種溶質(zhì)A和B，它們在相同條件下的分配常數(shù)分別為KA、KB，則分離系數(shù)的定義為：

=KA/KB=(CLA/CLB)/(CRA/CRB)本文檔共63頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二）有機(jī)溶劑的選擇1）選擇萃取用的溶劑應(yīng)考慮對產(chǎn)物有較大的溶解度和較好的選擇性。分離因素可以表征溶劑的選擇性如何，溶解度則由相似相溶的分子極性所決定。介電常數(shù)是一個化合物摩爾極化程度的量度；通過這一數(shù)值，可預(yù)知一個化合物是極性化合物還是非極性化合物。4）價(jià)格低廉，安全（如無毒、閃點(diǎn)高）常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇2）溶劑與被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面張力適中，對相的分散和相的分離有利；3）溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性高，回收和再生容易；本文檔共63頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三）影響水相溶質(zhì)溶解度的因素1）離子強(qiáng)度有些物質(zhì)在高離子強(qiáng)度下溶解度增加，如DNA-蛋白；有些則在低離子強(qiáng)度下溶解度增加，如RNA-蛋白；絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶存在“鹽溶”和“鹽析”現(xiàn)象；鹽析作用可以降低許多生化產(chǎn)物在水中的溶解度，也能減少有機(jī)溶劑在水中的溶解度。例如：在VB12的提取中，加入中性鹽硫酸銨，有利于VB12自水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中；在提取青霉素時加入NaCl，也有利于青霉素從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中。2）pH3）溫度溫度可改變物質(zhì)的溶解度，影響分配系數(shù)；一般生物物質(zhì)對溫度敏感，萃取多在室溫或低溫下進(jìn)行（通常0-10℃）；但也有采用熱提取法的（50-70℃），多用于一些小分子生物物質(zhì)4）帶溶劑

帶溶劑是一類能和所提取的生物物質(zhì)形成復(fù)合物，而易溶于溶劑的物質(zhì)，且此復(fù)合物在一定條件下易分解形成原來的生物物質(zhì)。提取水溶性強(qiáng)、在常用的有機(jī)溶劑中溶解度小的物質(zhì)時可采用添加帶溶劑；對于水溶性不強(qiáng)的物質(zhì)，也可通過帶溶劑提高收率和選擇性；

例如：鏈霉素是水溶性較強(qiáng)的堿，可與脂肪酸（如月桂酸）形成復(fù)合物，該復(fù)合物能溶于乙醇、醋酸丁酯等，而被萃取到有機(jī)相；在酸性條件下，又分解成鏈霉素而轉(zhuǎn)溶于水相。本文檔共63頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分四）乳化與去乳化在萃取過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)一種液體分散到另一種本不相溶的液體中，即乳化現(xiàn)象。乳化現(xiàn)象會造成有機(jī)溶劑相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶現(xiàn)象：

一是發(fā)酵液提取廢液中夾帶有機(jī)溶劑微粒，導(dǎo)致產(chǎn)品損失；二是有機(jī)溶劑相中夾帶發(fā)酵液微粒，會將雜質(zhì)帶入產(chǎn)品中。本文檔共63頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分油（有機(jī)溶劑）、水不溶→分層表面活性劑存在可發(fā)生乳化這類表面活性劑稱為乳化劑；1、乳濁液的成因及穩(wěn)定條件乳濁液有兩種：

水包油型(O/W型)油滴分散在水中油包水型(W/O型)水滴分散在油中本文檔共63頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分

由于乳化劑的兩性性質(zhì)，能夠?qū)⒈静幌嗳艿挠团c水連在一起，但其分子處在任何一相都是不穩(wěn)定的，只有處在兩相界面上時，親水基團(tuán)對著水，疏水基團(tuán)對向油，在相的界面上形成單分子層時，比較穩(wěn)定。乳化劑能夠降低表面張力，液體容易分散成微滴而發(fā)生乳化。

影響乳濁液穩(wěn)定性的因素包括是否在界面上形成保護(hù)膜，液滴的帶電性質(zhì)以及介質(zhì)的黏度；在發(fā)酵液中，蛋白對表面張力的影響最為顯著，隨著蛋白含量的增多，表面張力明顯下降，由此引起的乳濁液是相當(dāng)穩(wěn)定的。本文檔共63頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分CaCO3可被水浸潤，但不能被有機(jī)溶劑潤濕；將乳濁液通過CaCO3層時，乳濁液中的水分則被吸附。2、去乳化方法1）離心分離法2）提高溫度提高溫度可使黏度下降，使乳濁液穩(wěn)定性降低3）稀釋法4）電解質(zhì)破乳法離子型乳化劑所形成的乳濁液的穩(wěn)定性，是因其分散相帶有電荷；加入電解質(zhì)，可中和其電性，促使聚沉；常用NaCl、NaOH、HCl、Al3+等5）吸附法6）頂替法加入表面活性更強(qiáng)但不能形成保護(hù)膜的物質(zhì)，將原來的乳化劑從界面上頂替出來。

常用頂替劑有戊醇，其表面活性很強(qiáng)，但碳鏈很短，不能形成保護(hù)膜7）轉(zhuǎn)型法如果在O/W型乳濁液中加入親脂性的乳化劑，則乳濁液有從O/W轉(zhuǎn)變?yōu)閃/O型的趨向；但因在轉(zhuǎn)變過程中，其他條件還不允許形成W/O型乳濁液，而使乳濁液遭到破壞。去乳化劑：本文檔共63頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分五）萃取方式1、單級萃取多級逆流萃取包括若干萃取級，在第一級中加入料液，并逐漸向下一級移動，而在最后一級中加入萃取劑，并逐漸向前一級移動。料液移動的方向和萃取劑移動的方向相反，故得名。2、多級錯流萃取(multistagecross-flowextraction)由幾個萃取器串聯(lián)組成，料液經(jīng)第一級萃取后分離成兩個相；萃余相流入下一個萃取器，再加入新鮮萃取劑繼續(xù)萃取；萃取相則分別由各級排出，混合在一起，再進(jìn)入回收器回收溶劑，回收得到的溶劑仍作萃取劑循環(huán)使用。3、多級逆流萃取（multistagecounter-currentextraction）本文檔共63頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分五、離子交換法(Ionexchange)本文檔共63頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分一）離子交換樹脂的分類其活性基團(tuán)一般是磺酸基(-SO3H);由于是強(qiáng)酸性基團(tuán)，電離程度不受外界pH的影響，在pH1-14范圍內(nèi)均能起交換作用，一般沒有使用pH的限制。以與NaCl的交換為例：R-SO3H+NaClR-SO3Na+HCl其再生是用NaOH處理并水洗至pH8-9。再用HCl處理并用水洗至pH51、強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂2、弱酸性陽離子樹脂以羧基(-COOH)、酚羥基(-OH)等為活性基團(tuán)；其交換性能與溶液的pH有很大關(guān)系，因?yàn)檫@種樹脂的電離度很小。例如：羧基樹脂交換pH﹥7，酚羥基樹脂交換pH﹥9。在酸性溶液中，這類樹脂幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨溶液pH增高而增高。典型交換反應(yīng)：R-COOH+NaOHRCOONa+H2O

反應(yīng)生成的鹽RCOONa很容易水解并使溶液呈堿性，故鈉型樹脂不可能水洗到中性，一般只能水洗到pH8-9。3、強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂有兩種：

強(qiáng)堿Ⅰ型——含有三甲胺基

強(qiáng)堿Ⅱ型——含有二甲基--羥基-乙基胺Ⅰ型比Ⅱ型的堿性強(qiáng)，但再生困難；Ⅱ型的穩(wěn)定性則較差；強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂與強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂一樣，沒有使用pH的限制；典型交換反應(yīng)：RN(CH3)3Cl+NaOHRN(CH3)3OH+NaCl4、弱堿性陰離子交換樹脂活性基團(tuán)有伯胺基-NH2、仲胺基＝NH、叔胺基≡NH和吡啶基等；與弱酸性陽離子樹脂情況類似，交換能力隨pH的變化而變化，pH越低，交換能力越大；典型交換反應(yīng)：RNH3OH+HClRNH3Cl+H2O生成的鹽RNH3Cl很容易水解；這類樹脂與OH－的結(jié)合能力較強(qiáng)，容易再生成羥型，耗堿量也少。另有一些特殊的樹脂，如鰲合樹脂、兩性樹脂、氧化還原樹脂；大孔樹脂本文檔共63頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二）離子交換樹脂的命名法□□□×□交聯(lián)度連接符號順序號骨架號分類號大孔樹脂在前面加“D”本文檔共63頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分例如：001×7：強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，交聯(lián)度為7

D301：弱堿性苯乙烯系大孔陰離子交換樹脂

樹脂性質(zhì)分類骨架分類分類號樹脂種類骨架號骨架材料

0強(qiáng)酸性0苯乙烯系1弱酸性1丙烯酸系2強(qiáng)堿性2酚醛系3弱堿性3環(huán)氧系4鰲合性4乙烯吡啶系5兩性5尿醛系6氧化還原6氧乙烯系本文檔共63頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三）離子交換樹脂理化指標(biāo)合成樹脂時單體中交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的含量百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度。通常8%-12%；一般交聯(lián)度越大，樹脂越堅(jiān)固，機(jī)械強(qiáng)度越好，在水中不易膨脹；交聯(lián)度越低，樹脂越柔軟，越容易膨脹，越能很好地吸附較大的離子，達(dá)到交換平衡的速度越大；但機(jī)械強(qiáng)度差，吸附的選擇性??；1、交聯(lián)度2、膨脹度

樹脂不溶于水，但親水性強(qiáng)，具有親水膠體性質(zhì)，一般吸水膨脹，脫水收縮；

測定方法：將10-15ml風(fēng)干樹脂放入量筒，加入欲實(shí)驗(yàn)的溶劑（多為水），然后不時搖動，24h后，測定樹脂的體積。前后體積之比稱為膨脹系數(shù)；

膨脹系數(shù)與交聯(lián)度有一定關(guān)系，交聯(lián)度大的樹脂膨脹系數(shù)??；3、交換容量指一定量樹脂中可交換基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)，是表征樹脂性能的重要指標(biāo)。若將樹脂裝柱進(jìn)行操作，流出液中產(chǎn)物離子達(dá)到某一濃度時，操作即應(yīng)停止，樹脂進(jìn)行再生后再使用。這一濃度稱為漏出點(diǎn)。在漏出點(diǎn)時樹脂所吸附的量叫做工作交換容量。本文檔共63頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分四）離子交換工作原理

根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子不同，電荷不同的物質(zhì)對層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，不同物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。在離子交換過程中，離子首先擴(kuò)散到樹脂表面，通過樹脂擴(kuò)散到交換位置，在交換位置進(jìn)行離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹脂的結(jié)合越緊密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子擴(kuò)散到樹脂表面，洗脫液通過，被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中。本文檔共63頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分本文檔共63頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分大分子物質(zhì)要選擇交聯(lián)度低些的樹脂，小分子物質(zhì)則選用交聯(lián)度高的樹脂；由于交聯(lián)度低樹脂強(qiáng)度差、易破碎，因此，交聯(lián)度選擇的原則是在不影響交換容量的條件下，盡可能提高交聯(lián)度。五）離子交換樹脂的選擇1、首先要考慮的是產(chǎn)物的酸堿性質(zhì)

如強(qiáng)酸性物質(zhì)應(yīng)該選用弱堿性陰離子交換樹脂，這主要是從是否容易解吸的角度考慮的；因?yàn)閺?qiáng)堿性陰離子交換樹脂固然也能吸附強(qiáng)酸性物質(zhì)，但洗脫困難；

若產(chǎn)物為弱酸性物質(zhì)則應(yīng)選擇強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，如用弱堿性陰離子樹脂則不易吸附。

同理，強(qiáng)堿性產(chǎn)物則應(yīng)選用弱酸性陽離子交換樹脂；弱堿性產(chǎn)物則選用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。2、其次要考慮交聯(lián)度本文檔共63頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分如：當(dāng)產(chǎn)物分子是低價(jià)離子時，增加濃度有利于交換上柱；高價(jià)離子則在較低濃度下易被吸附。六）操作條件的控制1、交換條件控制1）最重要的是控制交換時的pH合適的pH應(yīng)該考慮三方面：a)應(yīng)在被吸附物質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)；b）能夠使被吸附物質(zhì)離子化；c）同時能使樹脂離子化2）在使用之前，樹脂還必須處理成一定的型式對于弱酸性和弱堿性樹脂，為了使其能離子化，應(yīng)采用鈉型或氯型；而強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性樹脂可采用任何型式，但若產(chǎn)物在酸性或堿性條件下易破壞的，則不能采用氫型或羥型；對于偶極離子的有機(jī)物，應(yīng)該采用氫型樹脂。3）要考慮到產(chǎn)物濃度對交換有影響本文檔共63頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分2、洗脫條件的控制洗脫條件正好與上柱條件相反如對pH范圍的選擇，若酸性上柱，則應(yīng)在堿性條件下洗脫；若堿性上柱，就采用酸性條件洗脫；本文檔共63頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分六、結(jié)晶法（crystallization）本文檔共63頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分

物質(zhì)從液態(tài)（液體或熔融體）或氣態(tài)形成晶體的過程叫結(jié)晶。結(jié)晶法常用于發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化本文檔共63頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分本文檔共63頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分一）晶體的一般性質(zhì)

許多性質(zhì)相同的粒子在三維空間有規(guī)律地排列成格子狀固體的物質(zhì)稱為晶體。晶體應(yīng)該是具有一定形狀的固態(tài)物質(zhì)，由許多性質(zhì)相同的粒子（原子、離子和分子）有規(guī)律地排列而成。

某些液體表面上看不像晶體，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)明顯具有晶體空間排列規(guī)律性，這種液體稱為液晶。本文檔共63頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分

大多數(shù)物質(zhì)結(jié)晶都是在溶液中進(jìn)行的，所以形成的晶體中常含有一定量的結(jié)晶水。晶體的含水量與晶體蒸汽壓強(qiáng)有關(guān)，當(dāng)晶體蒸汽壓強(qiáng)高于大氣蒸汽壓強(qiáng)時，則風(fēng)化失去結(jié)晶水。

晶體與非晶體的主要區(qū)別在于晶態(tài)物質(zhì)的許多性質(zhì)如光學(xué)和電學(xué)都具有方向性，即在同一方向上具有相同的性質(zhì)，在不同方向上具有相異性（稱為晶體各向相異性）；非晶體則不具此性質(zhì)。本文檔共63頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分二）晶體的結(jié)構(gòu)與分類

構(gòu)成晶體的微觀粒子（分子、原子或離子）按一定的幾何規(guī)則排列，由此形成的最小單元稱為晶格(crystallattice)。

如果結(jié)晶時沒有其他晶體或別的物質(zhì)干擾，作為質(zhì)點(diǎn)在空間晶格上排列的結(jié)果，晶體就具有明顯晶角和平滑晶面的外形。

雖然同一物質(zhì)的不同晶體，其晶面、晶邊相差很大，但對應(yīng)晶面所構(gòu)成的晶面角對同一物質(zhì)都是一樣的，這是物質(zhì)的一種特征。本文檔共63頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分考慮某一特定晶體，通常選擇3個主要的不平行晶面，稱為結(jié)晶軸平面；

晶軸(crystalaxis)晶軸可互相垂直，可兩軸互不垂直而垂直于第三軸，可以互相傾斜成相等的角度，也可以互相傾斜成不等的角度；除三晶軸平面外，可選擇第四個基本平面與所有三軸相交，而此平面與三軸所截的線段可作為沿各軸測量長度的單位。本文檔共63頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分晶體按晶格空間結(jié)構(gòu)，即按晶體的晶面角和晶軸長度，分為7種不同的晶系：立方晶系：三晶軸互相垂直且相等四方晶系：三晶軸互相垂直，其中兩軸長度相等，但不等于第三軸六方晶系：其三共面晶軸互相傾斜成60°，但其長度與相垂直的第四軸不相等；斜方晶系：三晶軸不等，且互成垂直；單斜晶系：三晶軸不等，其中兩者成傾斜，但垂直于第三軸；三斜晶系：三晶軸互相傾斜而長度不等，所有晶面角不等，且不等于30°、60°、90°；三方晶系：三晶軸長度相等，但相互傾斜度不等；本文檔共63頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分本文檔共63頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\1點(diǎn)42分三）生物物質(zhì)形成結(jié)晶的條件無論大分子還是小分子，均需達(dá)到一定純度；因雜質(zhì)可能影響結(jié)晶溶質(zhì)在晶面上的定向排列，或能與結(jié)晶溶質(zhì)化合或結(jié)合成絡(luò)合物；但要求純度不定，隨物質(zhì)種類而異；大多數(shù)蛋白質(zhì)要求達(dá)50%以上；1、樣品純度2、溶液的飽和度結(jié)晶形成的另一條件是溶解度的改變，合適的濃度才能增加分子的碰撞機(jī)會，使其能以一定的速度作定向排列聚集而形成晶體。濃度過高，溶質(zhì)分子在溶液中聚集析出的速度太快，超過這些分子形成晶體的速率，只能獲得無定型固體顆粒，而