江南大學(xué)微生物課件5

第六章

微生物菌種的選育江南大學(xué)生物工程學(xué)院本文檔共163頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種本文檔共163頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、生產(chǎn)菌株來源

索取或購(gòu)買自己選育用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取、購(gòu)買出發(fā)菌株進(jìn)行選從自然界中分離菌種

從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。本文檔共163頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分

設(shè)計(jì)方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)篩)→單株純種分離→性能考察(生產(chǎn)性能試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、菌種鑒定）從自然界中分離篩選菌種的一般步驟本文檔共163頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分一、采樣從自然界種采集含目的菌的樣品1. 環(huán)境條件對(duì)土樣本中微生物分布的影響營(yíng)養(yǎng)環(huán)境水分溫度通風(fēng)酸堿度

本文檔共163頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2 .采樣方法（1） 去除表層土（2） 取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意記錄：時(shí)間，地點(diǎn)，環(huán)境情況等樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去土樣應(yīng)在分離前破碎盡快分離本文檔共163頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時(shí)目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例原理：通過控制營(yíng)養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長(zhǎng)受到抑制本文檔共163頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、增殖培養(yǎng)的方法

控制營(yíng)養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基pH控制培養(yǎng)溫度

熱處理——增殖芽孢細(xì)菌添加抑制劑

本文檔共163頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)1.純種分離的一般方法（1）稀釋平板法傾注平板或涂布平板（2）劃線法（3）組織分離法*

適用于分離高等真菌及植物病原菌本文檔共163頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分稀釋分離涂布平板本文檔共163頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分稀釋分離傾注平板本文檔共163頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量

紙片培養(yǎng)顯色法透明圈法變色圈法生長(zhǎng)圈法抑制圈

本文檔共163頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序本文檔共163頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、厭氧性微生物的分離法（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh（2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培養(yǎng)罐化學(xué)除氧H2+O2→H2O(鈀作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生H2和CO2，H2與O2反應(yīng)生成水（3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)本文檔共163頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分GasPak本文檔共163頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分厭氧手套箱厭氧培養(yǎng)裝置本文檔共163頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分四

、篩選初篩、復(fù)篩：

本文檔共163頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分好氧培養(yǎng)本文檔共163頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分五、培養(yǎng)工藝條件試驗(yàn)與生產(chǎn)試驗(yàn)1、搖瓶發(fā)酵條件

培養(yǎng)基組成、初始pH、通風(fēng)量（裝液量）、接種量、培養(yǎng)溫度…2、小型臺(tái)式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…本文檔共163頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分第二節(jié)基因突變本文檔共163頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分

突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生了可遺傳的變化。突變是一種遺傳的狀態(tài)，是基因由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而由原來的存在狀態(tài)變?yōu)榱硪环N存在狀態(tài)，即它的等位基因。突變體：帶有突變基因的細(xì)胞或個(gè)體突變型：突變體的基因型或表型稱為突變型，和其相對(duì)的原存在狀態(tài)稱為野生型。21本文檔共163頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分一、突變類型按變化范圍分突變類型(一)染色體畸變（chromosomeaberration)染色體數(shù)目的變化或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生較大片段的異常改變。

1、染色體數(shù)目的變化整倍體(euploidy)：含有完整的染色體組單倍體：haploid二倍體：diploid三倍體：triploid四倍體：tetraploid本文檔共163頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一般是指二倍體中成對(duì)染色體成員的增加或減少。單體（二倍減一，monosomicdiploid):2n-1缺體（二倍減二，nullisomicdilpoid):2n-2三體（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1四體（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2雙二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1部分二倍體（merodiploid）：細(xì)菌等原核生物中由一整條染色體和外來的一個(gè)染色體片段所構(gòu)成的不完整二倍體。本文檔共163頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、染色體結(jié)構(gòu)的變化缺失deletion：重復(fù)duplication：倒位inversion：易位translocation：本文檔共163頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分bf本文檔共163頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(二)基因突變（genemutation）

----染色體局部座位內(nèi)的變化

點(diǎn)突變：只涉及DNA分子中一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基的改變。突變發(fā)生在一個(gè)基因范圍內(nèi)。多位點(diǎn)突變：突變超出一個(gè)基因范圍。1、堿基置換basereplacementDNA鏈上的某一堿基對(duì)為另一堿基對(duì)所取代。轉(zhuǎn)換transition：顛換transversion：本文檔共163頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(3)遺傳學(xué)效應(yīng)錯(cuò)義突變missensemutation：同義突變silentmutation：無義突變nonsensemutation：本文檔共163頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、移碼突變

frameshiftmutation：由于一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)（不是三的倍數(shù)）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遺傳密碼子的閱讀框發(fā)生移位錯(cuò)誤的突變。本文檔共163頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓G→AmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGCACG-3’↓C→TmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCTTTGTGCACG-3’↓C→AmutationPheAspLysProLeuStopThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGAACG-3’本文檔共163頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓InsertionofAPheAspLysThrLeuValHis5’-TTCGATAAGACCCTTGTGCACG-3’

本文檔共163頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分二、按表型效應(yīng)分突變類型野生型wildtype：表現(xiàn)該物種正常表型的生物。突變型mutant：由于突變導(dǎo)致其正常的表型發(fā)生了改變的生物。形態(tài)突變型生化突變型營(yíng)養(yǎng)缺陷型auxotrophicmutant

抗性突變型resistantmutant3.致死突變型4.條件致死突變型5.調(diào)節(jié)突變型本文檔共163頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分三、基因突變的規(guī)律不對(duì)應(yīng)性或自發(fā)性、

隨機(jī)性、稀有性、獨(dú)立性、穩(wěn)定性、可逆性、誘變性、本文檔共163頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、自發(fā)突變的證實(shí)隨機(jī)性、不對(duì)應(yīng)性

1）波動(dòng)實(shí)驗(yàn)2）涂布實(shí)驗(yàn)3）影印培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)本文檔共163頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分波動(dòng)實(shí)驗(yàn)本文檔共163頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分E.coliB抗噬菌體a的波動(dòng)測(cè)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)皿編號(hào)培養(yǎng)皿上菌落數(shù)樣品來自同一培養(yǎng)物樣品來自不同培養(yǎng)物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值16.751.43.311.35303.8方差15273.8694662040.8本文檔共163頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分四、突變的頻率：突變率（mutationrate）：每個(gè)細(xì)胞每一世代中發(fā)生突變的概率。世代總數(shù)=N2-N1突變率的測(cè)定：固體平板法測(cè)突變率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液體培養(yǎng)法測(cè)突變率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液體稀釋法測(cè)突變率：P0=e-mN細(xì)胞分裂非同步性效正：突變率=ln2m=0.69m本文檔共163頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分五、自發(fā)突變的機(jī)制環(huán)境因素的影響微生物自身產(chǎn)生的代謝物的影響轉(zhuǎn)座子所造成的插入突變DNA復(fù)制過程中偶爾發(fā)生錯(cuò)誤本文檔共163頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分六、誘變劑及其誘變機(jī)制誘變是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物而引起的突變。本文檔共163頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(一)物理誘變劑1）輻射：uv，x-射線γ-射線等效應(yīng)：點(diǎn)突變或染色體畸變機(jī)制：直接作用和間接作用間接作用：輻射作用于染色體外物質(zhì)，產(chǎn)生具有誘變作用的物質(zhì)；直接作用：輻射直接作用于染色體，2）熱：機(jī)理復(fù)雜離子束:能量傳遞、動(dòng)量交換，離子沉積與電荷積累過程本文檔共163頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、紫外線UV有效波長(zhǎng)2650?，紫外燈波長(zhǎng)2537?作用機(jī)理嘧啶二聚體、嘧啶水合物、交聯(lián)作用、DNA鏈斷裂效應(yīng)：移碼突變，堿基置換本文檔共163頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分

紫外線誘發(fā)胸苷二聚體本文檔共163頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、電離輻射：x-射線，g-射線作用機(jī)理直接作用：打斷化學(xué)鍵間接作用：通過自由基打斷化學(xué)鍵效應(yīng)：染色體畸變，堿基置換，移碼突變3、熱作用機(jī)理：脫嘌呤效應(yīng)：堿基置換，移碼突變4、離子束本文檔共163頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(二)化學(xué)誘變劑堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的堿基非常類似，因此能取代堿基參入到DNA分子中的一類化合物。主要誘變劑：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可誘發(fā)ATGC的轉(zhuǎn)換。本文檔共163頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分堿基類似物baseanalog5-溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶(5-FU，F(xiàn)U),5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鳥嘌呤（8-NG，NG）例：BU烯醇式：BUe，高頻出現(xiàn)，BUe≡G酮式：BUk，低頻出現(xiàn)，BUk=A本文檔共163頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分5-BU摻入后的摻入錯(cuò)誤G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU復(fù)制錯(cuò)誤A:T→G≡C本文檔共163頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2.移碼誘變劑嵌入DNA分子相鄰堿基對(duì)之間，從而有利于核苷酸的環(huán)出，因此可提高移碼突變的突變率。主要誘變劑：吖啶類化合物；溴化乙錠(ethidiumbromide)，ICR系列化合物等本文檔共163頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分部分移碼誘變劑

本文檔共163頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分DNA

插入劑本文檔共163頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3.化學(xué)修飾堿基的誘變劑1）烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷化反應(yīng)，從而更容易發(fā)生錯(cuò)配，是最常用的一類誘變劑。常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亞硝基乙基尿(NEU),亞硝基胍(NTG),乙烯亞胺(EI)等。NTG（亞硝基胍）誘變作用特強(qiáng)，作用于復(fù)制叉，可誘發(fā)多基因并發(fā)突變，被稱為超誘變劑。本文檔共163頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分ChemicalreactivityofbasesisresponsibleforsomeDNAlesion本文檔共163頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分Alkylatedbases部分烷化劑和烷化堿基alkylatingagents本文檔共163頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分DNA的脫嘌呤

本文檔共163頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分烷化鳥嘌呤的堿基配對(duì)

本文檔共163頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用

本文檔共163頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分如甲基黃酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G和O-4-E-T分別和T、G配對(duì)，導(dǎo)致G∶C對(duì)轉(zhuǎn)換成A∶T對(duì)；T∶A對(duì)轉(zhuǎn)換成C∶G本文檔共163頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2)

亞硝酸（introusacid,NA）有氧化脫氨作用，可使G第2個(gè)碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine,x），次黃嘌呤(H)仍和C配對(duì)，故不產(chǎn)生轉(zhuǎn)換突變。但C和A脫氨后分別產(chǎn)生U和次黃嘌呤H，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)換，使C∶G轉(zhuǎn)換成A∶T，A∶T轉(zhuǎn)換成G∶C本文檔共163頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3)羥胺（NH2OH）只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個(gè)C原子上加-OH，產(chǎn)生4-OH-C，此產(chǎn)物可以和A配對(duì)，使C∶G轉(zhuǎn)換成T∶A作用：與C反應(yīng)，造成GC→AT轉(zhuǎn)換本文檔共163頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactivation

本文檔共163頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、切補(bǔ)修復(fù)excisionrepair（暗復(fù)活）本文檔共163頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分第三節(jié)

誘變育種本文檔共163頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株↓純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液↓離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細(xì)胞或單孢子懸液↓活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)誘變處理↓活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算中間培養(yǎng)(后培養(yǎng))↓平板分離↓變異率計(jì)算初篩→復(fù)篩→保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)本文檔共163頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（一） 出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型2. 對(duì)誘變劑的敏感性具有特定生產(chǎn)性狀的可能性：要盡量選擇單倍體，單核細(xì)胞（孢子)本文檔共163頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（二）菌懸液的制備

細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)2.菌懸液的均一性：3.菌懸液細(xì)胞濃度酵母、霉菌孢子：106~107個(gè)/ml細(xì)菌、放線菌孢子：108個(gè)/ml4.菌懸液介質(zhì)：本文檔共163頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（三）誘變處理

1.誘變劑的選擇對(duì)于低產(chǎn)或野生菌，uv線往往是首選，烷化劑等也是常用的誘變劑；對(duì)于經(jīng)多次誘變處理的菌株，常需要強(qiáng)輻射進(jìn)行處理。堿基置換易回復(fù)，染色體畸變、移碼等不易回復(fù)細(xì)胞的透性和生理狀態(tài)經(jīng)常變換誘變劑或復(fù)合處理本文檔共163頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2.劑量選擇最適劑量因誘變劑的類型、出發(fā)菌株及其生理狀態(tài)的不同而不同。亞硝基胍在低死亡率劑量時(shí)突變率較高，而uv則在高致死率時(shí)才有較高的突變率。高產(chǎn)菌株在低劑量時(shí)效果較好，而對(duì)多核細(xì)胞處理劑量不宜過低。質(zhì)量性狀宜選用高劑量。經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理來激活本文檔共163頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3處理方法單一誘變劑處理;復(fù)合處理乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果

1-對(duì)照；2-乙烯亞胺（濃度1:7000）；3,5,7,9-紫外線；4,6,8,10-乙烯亞胺加紫外線

紫外線的劑量（erg/mm2）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000

本文檔共163頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分X-射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株39#變異的關(guān)系

形態(tài)突變型

負(fù)突變型

正突變型

本文檔共163頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293#變異的關(guān)系

本文檔共163頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（四）后培養(yǎng)目的使突變基因純合并表達(dá)，消除表型延遲。

后培養(yǎng)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)要求豐富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各種生長(zhǎng)因子。本文檔共163頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（五）變異菌株的分離及篩選

篩選：包括初篩，復(fù)篩和終篩等。明確篩選目標(biāo)：產(chǎn)量突變還是其它突變型；產(chǎn)量準(zhǔn)備提高多少等；一次誘變目標(biāo)不要太高制定篩選方案：篩選準(zhǔn)備分幾步；篩選采用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件；每一步準(zhǔn)備篩選多少菌株；每一步準(zhǔn)備采用的分析方法等。本文檔共163頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分誘變育種工作中應(yīng)注意的問題安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操作中應(yīng)時(shí)刻注意安全問題：個(gè)人安全和環(huán)境安全。個(gè)人安全：操作時(shí)注意防護(hù)，不同誘變劑要求不同防護(hù)方法，如γ-射線輻射防護(hù)要求較高，uv要求較低，而化學(xué)誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸；環(huán)境安全：所用物品要經(jīng)解毒處理；液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放。要養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣：如仔細(xì)觀察細(xì)微的形態(tài)變化、要詳實(shí)記錄菌株的誘變史和誘變譜系。誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合。誘變育種由于其篩選的盲目性，突變的不定向性，工作量十分大，因此要對(duì)整個(gè)工作進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率。本文檔共163頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分二

、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）突變株：是指喪失了合成一種或多種必需生長(zhǎng)因子能力的菌株，它們只能在補(bǔ)充了相應(yīng)的生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基上才能正常生長(zhǎng)。本文檔共163頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的用途

科研上：研究代謝途徑；基因重組的遺傳標(biāo)記菌種；AA、堿基、維生素生物測(cè)定的試驗(yàn)菌種生產(chǎn)上：發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸，核苷酸的生產(chǎn)菌種；生產(chǎn)菌株雜交育種的親本進(jìn)行遺傳標(biāo)記本文檔共163頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分完全培養(yǎng)基CompleteMedium（CM）含有滿足某微生物的所有營(yíng)養(yǎng)缺陷型和野生型菌株生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的天然或半合成培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基MinimalMedium（MM）：不含生長(zhǎng)因子僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基SupplementedMedium(SM)：補(bǔ)充了一種或數(shù)種生長(zhǎng)因子，以滿足某微生物的特定的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，其中的生長(zhǎng)因子多是通過直接添加AA、堿基或維生素而提供。本文檔共163頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(一)篩選方法

后培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型本文檔共163頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、淘汰野生型原理：限制營(yíng)養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，野生型細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中被殺死或生長(zhǎng)后被除去方法：抗生素法：菌絲過濾法：適用于絲狀真菌差別殺菌：

本文檔共163頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分抗生素淘汰野生型饑餓培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后，懸浮于無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2小時(shí)，耗盡細(xì)胞內(nèi)氮源，防止加抗生素后的“誤殺”；加抗生素處理：加入等體積的2N基本培養(yǎng)基（兩倍濃度氮源的基本培養(yǎng)基），同時(shí)加入抗生素，培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型細(xì)胞由于生長(zhǎng)而被殺死，缺陷型細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)而得以保留。制霉菌素可用于處理酵母菌和霉菌。注意：培養(yǎng)基應(yīng)添加滲透壓穩(wěn)定劑而制成高滲培養(yǎng)基，可避免由于細(xì)胞破裂而給缺陷型提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本文檔共163頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、檢出缺陷型1）限量補(bǔ)充法2）夾層培養(yǎng)法3）逐個(gè)檢出法4）影印培養(yǎng)法本文檔共163頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、鑒定缺陷型----生長(zhǎng)譜法大類的鑒定：營(yíng)養(yǎng)因子：A、酪素水解液（AA混合物）B、水溶性維生素混合液C、酵母核酸水解液（堿基）D、酵母膏水溶液制備平板：缺陷型菌經(jīng)CM液體培養(yǎng)后，離心洗滌，制成107~108個(gè)/ml菌懸液。取0.1ml涂布至MM平板上ABCD本文檔共163頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分方法：分別用無菌小濾片沾取少許各種營(yíng)養(yǎng)因子后，放入接種的MM上，適宜溫度下培養(yǎng)判斷：A、D生長(zhǎng)，AA缺陷型B、D生長(zhǎng)，維生素缺陷型C、D生長(zhǎng)，堿基缺陷型A~B、D生長(zhǎng)，AA、維生素雙缺A~C、D生長(zhǎng)，AA、堿基雙缺B~C、D生長(zhǎng)，維生素、堿基雙缺本文檔共163頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分組生長(zhǎng)因子甲123456乙27891011丙3812131415丁4913161718戊51014171920己61115182021詳細(xì)鑒定生長(zhǎng)因子組合法本文檔共163頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)譜鑒定本文檔共163頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨基庚二酸LysAKase鈍齒棒桿菌L-賴氨酸生物合成途徑及調(diào)節(jié)本文檔共163頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分不同類型突變株積累L-賴氨酸的水平突變菌株突變型產(chǎn)量(mg/ml)鈍齒棒桿菌Hse-17.93鈍齒棒桿菌Thr

-2.33鈍齒棒桿菌Thr

-+Met

-2.00鈍齒棒桿菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒桿菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0本文檔共163頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分三、其它類型突變型的篩選（一）抗代謝類似物突變型的篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株：是指一種對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型突變株，或兼而有之的突變株。代謝類似物：結(jié)構(gòu)與代謝物類似，因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用的一類化合物。本文檔共163頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、抗反饋抑制突變發(fā)生基因突變的細(xì)胞：酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變導(dǎo)致調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位發(fā)生改變，不再與結(jié)構(gòu)類似物（或產(chǎn)物）結(jié)合，從而解除了產(chǎn)物的反饋抑制作用，使產(chǎn)物得以合成。本文檔共163頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分突變前突變后抗反饋抑制突變的機(jī)制本文檔共163頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、抗反饋?zhàn)瓒敉蛔冃陀捎谡{(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和輔阻遏物結(jié)合，或由于操縱基因發(fā)生突變，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突變的操縱基因，從而解除產(chǎn)物的阻遏作用，使產(chǎn)物得以過量積累。本文檔共163頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兊臋C(jī)制本文檔共163頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、篩選方法（1）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞直接涂布在含有一定濃度結(jié)構(gòu)類似物的基本培養(yǎng)基平板上，長(zhǎng)出的菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；（2）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞涂布在基本培養(yǎng)基平板上，在平板的中央加少量結(jié)構(gòu)類似物，在抑菌圈內(nèi)長(zhǎng)出的個(gè)別菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；本文檔共163頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分注意：如果是協(xié)同反饋抑制，則要在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物抗結(jié)構(gòu)類似物突變是數(shù)量性狀，可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物的濃度使產(chǎn)物的積累水平逐漸提高本文檔共163頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分結(jié)構(gòu)類似物和代謝終產(chǎn)物終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物過量積累產(chǎn)物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸對(duì)氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸賴氨酸AEC賴氨酸酪氨酸對(duì)氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色氨酸5-堿基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氫脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脫氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖,麥芽糖2-脫氧棉子糖蔗糖酶纖維二糖,葡萄糖甘油纖維素酶本文檔共163頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（二）組成型酶突變株的篩選1、誘導(dǎo)型酶在生產(chǎn)上的缺點(diǎn)誘導(dǎo)物往往價(jià)格昂貴受誘導(dǎo)物種類，濃度及分解產(chǎn)物的影響2、篩選原理

通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。本文檔共163頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、篩選方法

創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長(zhǎng)而不利于誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，造成對(duì)組成型的選擇優(yōu)勢(shì)或者適當(dāng)?shù)淖R(shí)別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。恒化器法

以誘導(dǎo)物作底物，濃度低于起誘導(dǎo)作用濃度，誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)極弱，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶，則能分解底物而得以生長(zhǎng)，通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，使變異株數(shù)量逐漸增多，最后達(dá)到能分離的濃度。本文檔共163頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分循環(huán)培養(yǎng)法不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基?含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基(普通碳源或氮源）（誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源）兩菌都能生長(zhǎng)，但組成型變異株已能合成特定的酶，親株不能變異株調(diào)整期短，親株調(diào)整期長(zhǎng)，短時(shí)間培養(yǎng)后，變異株所占比例增大

反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比例逐漸提高，然后進(jìn)行分離本文檔共163頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（三）細(xì)胞膜透性突變型

1、提高細(xì)胞膜透性的優(yōu)點(diǎn)使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，提高產(chǎn)物的生成量使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的程度，以積累過量的產(chǎn)物2、提高細(xì)胞膜透性的措施本文檔共163頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分第四節(jié)基因重組本文檔共163頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分遺傳重組的一般概念遺傳重組（基因重組）：遺傳重組是指遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞傳遞并導(dǎo)致DNA交換和重排的過程。遺傳改造的手段包括基因突變和基因重組微生物中基因重組的方式：

真核微生物：有性生殖和準(zhǔn)性生殖；原核微生物：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)本文檔共163頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分一、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化定義：受體細(xì)胞直接吸收裸露的外源DNA并與其自身遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，從而使受體細(xì)胞獲得共體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。1、轉(zhuǎn)化過程感受態(tài)受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的吸附和吸收轉(zhuǎn)化因子的整合及轉(zhuǎn)化子的形成本文檔共163頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分轉(zhuǎn)化過程本文檔共163頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分轉(zhuǎn)化因子的整合本文檔共163頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分二、轉(zhuǎn)導(dǎo)Transduction

通過噬菌體作為媒介，而把一個(gè)細(xì)菌的基因?qū)肓硪粋€(gè)細(xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分：供體細(xì)菌，受體細(xì)菌，轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體本文檔共163頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（一）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)specializedtransduction

只能傳遞供體染色體上原噬菌體整合位點(diǎn)附近的少數(shù)固定基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成

Campbell模型（不正確切離）形成頻率：10-6

本文檔共163頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得——雙交換不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得——溶原化

本文檔共163頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（二）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

generalizedtransduction能傳遞供體的任何基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成選擇性包裹模型形成頻率：10-6本文檔共163頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成完全轉(zhuǎn)導(dǎo)與完全轉(zhuǎn)導(dǎo)子Completetransduction通過雙交換而實(shí)現(xiàn)約占1/10本文檔共163頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)與流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子

Abortivetransduction進(jìn)入受體的供體DNA片段既不復(fù)制，也不整合，但能正常表達(dá)。本文檔共163頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、共轉(zhuǎn)導(dǎo)cotransduction由一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體同時(shí)傳遞兩個(gè)供體基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率本文檔共163頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)能轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因供體的任何基因特定基因,l:gal,bio噬菌體在供體菌中的位置無特定的位置有特定的位置gal-l-bio轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的獲得自發(fā)裂解或誘導(dǎo)裂解誘導(dǎo)裂解轉(zhuǎn)導(dǎo)子非溶源性1/10穩(wěn)定的完全轉(zhuǎn)導(dǎo)子9/10不穩(wěn)定流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子缺陷溶源性1/3穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子2/3不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子本文檔共163頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分三、細(xì)菌的接合供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。Conjugationisthemechanismbywhichgeneticmaterialistransferredbetweentwocellsbyplasmids.本文檔共163頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、F-、F+、Hfr菌株F+菌株Hfr菌株F-菌株F+Hfr本文檔共163頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、細(xì)菌接合作用（1）F+×F-結(jié)果：F-轉(zhuǎn)變?yōu)镕+本文檔共163頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（2）Hfr×F-

HfrDNA的轉(zhuǎn)移本文檔共163頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第121頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分形成部分雜合子本文檔共163頁；當(dāng)前第122頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分通過雙交換形成重組體形成lac+ade+重組體形成lac-ade+重組體本文檔共163頁；當(dāng)前第123頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分相同點(diǎn)

含有F因子，都具有性纖毛，都具有接合作用不同點(diǎn)Hfr細(xì)菌F+

對(duì)于吖啶橙處理穩(wěn)定F因子易失去傳遞供體染色體基因高頻(10-3~10-4)低頻(10-6~10-7)F因子本身轉(zhuǎn)移基本不能頻率70%以上F因子復(fù)制隨細(xì)菌染色體復(fù)制獨(dú)立復(fù)制F+與Hfr菌株的異同點(diǎn)本文檔共163頁；當(dāng)前第124頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分3、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)

F’因子：帶有細(xì)菌基因的F因子。例F-lac，F(xiàn)-gal，F(xiàn)-pro…F’因子的形成：Hfr菌株中F因子的異常切除（aberrantexcision)F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（性因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)）通過F’因子的轉(zhuǎn)移而使受體細(xì)菌改變其遺傳性狀的現(xiàn)象本文檔共163頁；當(dāng)前第125頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第126頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分四、真菌的有性生殖Sexualreproduction一、真菌有性生殖過程二、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的生活史本文檔共163頁；當(dāng)前第127頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第128頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分五、真菌的準(zhǔn)性生殖Parasexualreproduction能進(jìn)行準(zhǔn)性生殖的微生物：Aspergillusnidulans;Asp.niger;Asp.sojaePenicilliumchrysogenum;Fusariumoxysporum（一）準(zhǔn)性生殖的過程異核體形成；（雜合）二倍體形成；體細(xì)胞交換和單元化本文檔共163頁；當(dāng)前第129頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、異核體的形成異核體細(xì)胞：并存有兩個(gè)不同遺傳性狀的核的細(xì)胞異核體菌絲體：由異核體細(xì)胞構(gòu)成的菌絲體異核體的無性繁殖：產(chǎn)生親代類型的單倍體分生孢子異核體的生物學(xué)意義：具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；可以儲(chǔ)備隱性突變本文檔共163頁；當(dāng)前第130頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、異核體的形成(1)選擇親本A.親緣關(guān)系近B.生活力、產(chǎn)生分生孢子的能力及數(shù)量相似C.帶不同的遺傳標(biāo)記(2)創(chuàng)造形成異核體的條件A.限制性培養(yǎng)基B.孢子混合數(shù)量：106~108本文檔共163頁；當(dāng)前第131頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（二）雜合二倍體的形成1、形成：將106~107個(gè)異核體的分生孢子涂至MM上，長(zhǎng)出的少數(shù)菌落即為二倍體2、檢出：避免異核體分生孢子重新形成異核體的措施MM要十分純正采用具有分生孢子顏色突變型和營(yíng)養(yǎng)缺陷型作遺傳標(biāo)記本文檔共163頁；當(dāng)前第132頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（三）有絲分裂分離二倍體在有絲分裂過程中發(fā)生基因重組，使隱性基因得以表達(dá)，由此產(chǎn)生各種類型的分離子。1、體細(xì)胞交換與體細(xì)胞重組體（1）體細(xì)胞交換：在有絲分裂過程中同源染色體發(fā)生的交換。由此導(dǎo)致部分基因的純合化。本文檔共163頁；當(dāng)前第133頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第134頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2、單元化過程與非整倍體及單倍體分離子單元化過程：是在一系列有絲分裂過程中發(fā)生的染色體不離開行為的結(jié)果。

本文檔共163頁；當(dāng)前第135頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分有性生殖與準(zhǔn)性生殖的區(qū)別有性生殖準(zhǔn)性生殖導(dǎo)致有性孢子的產(chǎn)生，其形態(tài)、生理均與營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞不同，往往產(chǎn)生在特殊的囊器中導(dǎo)致重組體細(xì)胞產(chǎn)生，其和一般營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞相同，不產(chǎn)生在特殊的囊器中減數(shù)分裂導(dǎo)致基因重組，減數(shù)分裂中染色體交換和減半是有規(guī)律的協(xié)調(diào)過程，是必然的有絲分裂導(dǎo)致基因重組，有絲分裂中，染色體交換和減少是不規(guī)則且不協(xié)調(diào)的過程，是偶然的本文檔共163頁；當(dāng)前第136頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分六、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)：基因重組頻率提高重組的親本范圍擴(kuò)大融合子集中兩親本優(yōu)良性狀的機(jī)會(huì)增大

本文檔共163頁；當(dāng)前第137頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分（一）原生質(zhì)體融合技術(shù)的一般步驟融合親本的選擇與標(biāo)記；原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的融合；原生質(zhì)體的再生；融合子的選擇與鑒定；目標(biāo)菌株的篩選。本文檔共163頁；當(dāng)前第138頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分七、基因工程育種Geneticengineering重組DNA技術(shù)：recombinantDNAtechnology

基因工程是將不同生物的基因在體外人工剪切組合并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。本文檔共163頁；當(dāng)前第139頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分目的基因(DNA)載體DNA重組DNA受體細(xì)胞具表達(dá)目的基因功能的重組菌DNA連接酶轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染篩選（利用遺傳標(biāo)記或分子生物學(xué)方法等）

基因工程操作的主要過程本文檔共163頁；當(dāng)前第140頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分一、目的基因的獲得主要方法化學(xué)合成

PCR擴(kuò)增從DNA文庫中篩選本文檔共163頁；當(dāng)前第141頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分1、PCR體外擴(kuò)增目的基因PolymeraseChainReaction——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段(靶序列）在DNA聚合酶催化下，通過兩條人工合成的單鏈引物的引導(dǎo)而擴(kuò)增模板DNA片段的方法本文檔共163頁；當(dāng)前第142頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(1)基本PCR組成：含目標(biāo)DNA序列的模板DNA(Template)寡核苷酸引物(Primers)：界定復(fù)制范圍兩端的引物DNA聚合酶：(Taq.Polymearse)DNA合成底物及水：dNTPs本文檔共163頁；當(dāng)前第143頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分(2)PCR反應(yīng)——三個(gè)主要步驟變性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：50~65℃延伸(extension)：72℃20~30個(gè)循環(huán)本文檔共163頁；當(dāng)前第144頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第145頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分本文檔共163頁；當(dāng)前第146頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分2.基因文庫法（1）從共體菌基因組DNA獲取目的基因DNA文庫：

生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。分離染色體DNA用限制性酶部分水解分離選出一定大小合適克隆的DNA片段本文檔共163頁；當(dāng)前第147頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分基因文庫構(gòu)建步驟提取DNA酶解電泳分離與載體連接導(dǎo)入宿主篩選陽性克隆本文檔共163頁；當(dāng)前第148頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分二、優(yōu)良載體的選擇優(yōu)良載體應(yīng)具備的特點(diǎn)對(duì)E.coli受體細(xì)胞，載體有質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體三、目的基因與載體DNA的體外重組粘性末端連接平齊末端連接本文檔共163頁；當(dāng)前第149頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分四.重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染體外包裝與感染電穿孔法electroporation本文檔共163頁；當(dāng)前第150頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分五、重組受體細(xì)胞的篩選和鑒定遺傳學(xué)方法：檢測(cè)選擇性標(biāo)記免疫化學(xué)方法：檢測(cè)目的基因產(chǎn)物核酸雜交方法：檢測(cè)目的基因直接檢出法：檢測(cè)基因產(chǎn)物本文檔共163頁；當(dāng)前第151頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分外源基因插入tet鈍化tetr受體細(xì)胞是Amp、Tetd的敏感型在Amp+Tet培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的是野生型質(zhì)粒在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的帶有重組質(zhì)粒選擇性標(biāo)記篩選例一本文檔共163頁；當(dāng)前第152頁；編輯于星期二\16點(diǎn)38分例二、b