WesternBlot技術專輯之PAGE膠電泳和轉膜

WesternBlot技術專輯之膠電泳和轉膜

倒膠的儀器我們在前面WesternBlot儀器之選已經介紹過了，除了順手的工具能防止漏

膠，配膠的試劑和配方比例對電泳結果的質量固然有打算性的影響，這個配膠的比例，在

《分子克隆》上有具體的論述，信任大家都不難查到。簡潔無視的問題主要在于過硫酸錢

（AP）肯定要穎一一最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度,超過2周的AP扔掉算了,

或者己經反復翻開使用屢次的AP都別用，小氣病發(fā)作的后果往往是得不償失

一膠凝不好多半是這里疏忽（或者混合不勻），由于相對配膠的其他組分，AP算最活潑分

子一一假設還有諸如漏加某組分或者配比錯誤或者Buffer搞錯，那確定是你自己找罵，不

值得憐憫。水要用去離子的純水，MilliQ級更好。Cambrex（原來的FMC）有商品化的丙烯酰胺

母液，很貴，也很好一一配出的膠對200KD以上的蛋白的區(qū)分率高于一般膠，條帶清楚秀麗,

惋惜始終沒有搞清楚配方的奇特；但是數十倍于丙烯酰胺粉劑的價格令人卻步，不過，對接觸丙烯

酰胺粉塵嚴峻過敏的人可以選擇這個。更加豪華的選擇是已經凝好的預制膠，各種配方各種

比例各種梳孔大小多少任君選擇，翻開即用，固然更直接便利，更吸引人的是結果秀麗，區(qū)

分率高，特別是重復性好，條帶真正是“razorsharp”?。こ６寄苡眠@么豪華的東西心情

固然超爽啊，試驗緊湊又輕松，效率也更高??！假照試驗都能這么“好馬配好鞍”，想必更簡

潔出結果，也就更簡潔拿經費吧！什么時候我們的試驗才能實現這種良性循環(huán)?。nvitrogen

旗下的Norvex和Cambrex（原來的FMC）r都是首選預制膠?？墒窃凇吧鐣髁x初級階段”這

種鋪張品尋常流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了的優(yōu)待活動，買3盒Nu預

制膠就送電泳儀或者電轉移，面對這種誘惑，你莫非就沒有一點非份之想的沖動？

上樣電泳：上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結果時，每個條帶都彎彎地

“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，依據說明把握電流，不要過多重復使用電泳Buffer

（別小氣，重復使用會降低緩沖力量的），好似根本不會出問題了。當預染的Marker告知

你，你要區(qū)分的蛋白已經到達最正確區(qū)分區(qū)一一分別膠的2/3處，0K,電泳完畢了。

電泳結果檢查：假設要做WesternBlot,是否需要先檢查電泳結果呢？能先看看結果如何

再進展下一步轉膜固然最好。考馬斯亮藍使用簡便快速，可以區(qū)分lug左右的條帶，是最經

濟通用的蛋白膠電泳染色方法。銀染操作簡單一些但區(qū)分率高很多，可以區(qū)分2-5ng蛋白。

可是由于考馬斯亮藍染色或者銀染經過固定不行逆結合，會干擾后面的WesternBlot

試驗，很多人會選擇省略掉這一步一一同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉膜，一般也可以

說明問題。假設想在轉膜前看看電泳結果，你需要用SYPROTangerine——這種金色熒光蛋白

染料靈敏度很高一一檢測4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用格外簡潔，最重要的是由于不用酸

堿或者有機溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉膜前的染色，或者非變性膠的活

性蛋白的檢測（比方染色后還需要在膠上進展活性檢測等等）。惋惜SYPROTangerine價格

挺貴的，500ul（5000x）要2022元，即使很節(jié)約的用只夠或許100屢次呢。所以最經濟實惠

的方法是：麗春紅S,直接染色轉移膜，檢測轉膜效果，充分脫色后不干擾Western結果。麗

春紅的檢測靈敏度和考馬斯亮藍差不多。

轉膜：經過電泳分別后的蛋白質樣品需要經過“轉膜”步驟一一從膠轉移到膜上固定，才

能用各種方法進展WesternBlot的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的狀況下已經分別

的蛋白條帶集中，轉移要盡快進展轉膜的首要是選膜。在轉移膜上顯色其實就像是畫家在畫布

上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當之重要。WesternBlotting亦

是如此，沒有選擇好適宜的轉移膜是無法做出秀麗的結果的。因此，選擇適合的轉移膜，要

讓轉移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的試驗。

WesternBlot印跡常用的轉移膜主要是硝酸纖維素膜（NitrocelluloseBlotting

Membranes,NO和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）,此外也有用尼龍膜、DEAE纖

維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些試驗呢？選擇的依據主要有：a.膜與目的蛋白分子

的結合力量（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的

大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.假設

后繼試驗有其他要求，比方要做蛋白測序或者質譜分析，還要依據不同目的來選擇不同的轉移

膜，就像國畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。

首先來比較下這幾種膜的特點

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靈敏度和分高高高

辨率

背景低較高低

125—200ug/cm2（適合于

結合力量80-110ug/cm2>400ug/cm2SDS存在下與蛋白質的結

合）

材料質地干的NC膜易脆軟而結實機械強度高

溶劑耐受性無無有

操作程序緩沖液潤濕,避開氣泡緩沖液潤濕使用前100%甲醇潤濕

常規(guī)染色，比較于NC膜，

常規(guī)染色，可用放射性和可用考馬斯亮藍染色，可

檢測方式不能用陰離子染料

非放射性檢測用于ECL檢測，快速免疫

檢測。

0.45um一般蛋白低濃度小分子蛋

0.2um一分子量小于20kD白、酸性蛋白、糖

適用范圍蛋白蛋白和蛋白多糖糖蛋白檢測和蛋白質測序

0.lum一分子量小于7kD蛋（主要用在核酸檢

白測中）

價格價格較廉價廉價較貴

1.硝酸纖維素膜

硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉移介質，對蛋白有很強的結合力量，而且適用于

各種顯色方法，包括同位素，化學發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景

低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比方不需要甲醛預處理，只要在無離子水面浸潤排

出膜內氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比方NC膜很簡潔封閉，也不需要特

別嚴謹的清洗條件。轉移到NC膜上的蛋白在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，

Schleicher&Schull公司的一個試驗說明，轉移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5

年照舊保持免疫識別特性，照舊可以得到清楚可信的WesternBlot結果。不過要留意的是

純的硝纖膜在比較脆，又簡潔卷，操作要留神，不適合用于需要屢次重復清洗的用途——因

為經不起屢次“熬煎”。選擇硝纖膜時要留意的是選擇適宜的孔徑，通常20KD以上的大分

子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，假設小于7KD的話最好選擇

0.luni的膜。另外還要留意選擇純的NC膜一一混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結合力會有所

降低。另外提示一句：由于NC膜上結合的蛋白會由于一些去污劑而被代替，因此在封閉時

最好使用較溫存的Tween20,而且濃度不要超過0.3%(據說0.05%效果最好)。

硝纖膜最為大家生疏和認可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL,另外

羅氏、Invitrogen、GE(Amersham)>SantaCruz等公司都有供給各式的硝纖膜(估量OEM

的可能性比較大，不過有時挺驚異的，OEM的有時比生產廠家賣的還廉價)。Schleicher&

Schull的名字拗口一一那或許需要舌頭在口腔里經過假設干次不同弧度和不同速度的上下來

回準確運動再協作適當的吐氣才能讀得準確優(yōu)雅，不過作為第一個供給硝纖膜的廠家照舊廣為

人知，其NC膜分為純NC膜和強化NC膜兩種：Protrannitrocellulosemembrane和

Optitrannitrocellulosemembrane。前者Protran始終是Schleicher&Schul1驕傲的產

品，這種a100%PureNitrocelluloseMembranes"。一般而言，NC膜越純，其蛋白結合力

量就越高，所以要增加WB的靈敏度和區(qū)分率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。假

設NC膜攙雜一些醋化纖維素——這在前面己經提到，會影響蛋白質結合。而Protran在制作過

程中去除了各種雜質，保證了其純度，從而增加了蛋白結合力量。除了這一點以外，Protran還有

低背景、多孔徑選擇(0.45,0.2,0.lum)和保存時間長(試驗證明膜上蛋白識別時間可長

達5年！真是“路遙知馬力”的典范)等優(yōu)點。但是Protran由于是純NC膜，比較脆，機械

耐受力欠佳，需要留神操作，假設擔憂自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或

者Pall公司的以耐受力著稱的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane,

Optitran是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，結果外表看

起來和純硝纖膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點，只是內部多了一層中性支持物，大大增

加這種強化NC膜的柔韌度和機械耐受力，不簡潔卷曲，便利操作，特別是重復標記和洗脫

的試驗。不過有的使用過的人反響不如純NC膜結合力量強。NC膜除了一般的Discs、Rolls

和Sheets以夕卜,像Invitrogen、Bio-Rad公司還有一種便利顧客使用的"sandwich”三明

治形，格外好玩。說它好玩是由于考慮周到，利于高通量操作，但其實也就是將濾紙和NC

膜紙?zhí)壮蔀V紙一NC膜一濾紙的層迭形式，預先切割裝訂好，便利使用。不過，卷膜確定是

最實惠的選擇，只不過要自己動手裁剪——切記，必需帶手套操作。不知道為什么在國外硝

纖膜會被當作危急品來運輸還要加收運費，所以貨期蠻長的，所以還是卷膜好，一卷用n

年一一假設非要給這個n加個期限，那就是至少可以用到等我畢業(yè)之后。

2.PVDF膜

剛開頭做WB的人或許會有這種疑問：為什么試驗室的教師（或者師兄師姐們）在教我們

做WB的時候，假設是用PVDF膜做，總是留神翼翼的剪，節(jié)約著用，甚至一些邊邊角角也舍

不得丟掉呢？其實，這不僅是由于PVDF膜比較貴，還由于PVDF膜是做WB的“殺手銅”。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作為基質的轉印膜由Millipore公司在1985年首先推出。與

硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質截留力量，機械強度和化學相容性上都更優(yōu)越的性能

（Pluskal,etal.,1986）.市售硝酸纖維素膜的典型結合量是80T00口g/cm2,而PVDF膜結

合量是100-200Mg/cm2（而結合強度PVDF比硝纖膜強6倍?。Ｔ诎滩《荆℉IV）血清

學檢驗中直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更好的截留總HIV抗原力量并提高抗

體檢測糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的優(yōu)點不僅于此：更好的機械強度和化學

耐受性使PVDF膜在各種染色應用和多重免疫檢測中成為抱負選擇；而且單個凝膠的泳道復

本可用于多種目的，如考馬斯亮藍染色后切出條帶并進展N-末端測序、蛋白消化/肽分別/

內部測序和免疫檢測（Kurien,etal.,2022）?特別是需要做N端蛋白測序，在相當“嚴酷”

的清洗條件下，當尼龍或者硝纖膜已經降解的狀況下PVDF膜照舊保持本色，笑傲江湖。所

以PVDF也是要做蛋白測序的唯一選擇。此外，個人閱歷，一些強疏水蛋白用PVDF膜效果會更

好一些。PVDF膜適用的檢測方法也不少，化學發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標準染色都一樣

0K,但不適合熒光。PVDF膜特別留意的是需要100%甲醇預處理（不超過15秒）再用緩沖液

平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理（不過要真消滅這種問題也是自

己欠扁，誰要你不留神呢，轉膜前處理也就罷了，轉膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識

別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對小分子蛋白有較好的攔截吸附,

背景可能會比前者稍高。

PVDF膜常見的有以下幾個品牌

口

公司產口口X名/孔徑適用范圍參考價格

MilliporeImmobilonTransfer0.45um$212

Membranes0.2urn

Bio-RadImmun-BlotPVDFChemiluminescent,

Membranecolorimetricwestern

blots,

amino-terminal

sequenceandtotal

aminoacid

composition

PiercePVDFMembrane0.45umWestern,Southern,

0.2umNorthern,anddot

blots

PallLifeBioTracePVDFTransfer0.45umNucleicacidand$149

ScienceMembraneproteintransfers.

Proteinsequencing

InvitrogenPVDFMembrane0.45umProteinsequencing,￥1625.8

0.2urnimmunoblotting

WhatmanWestranClearSignal0.45umWesternblots

PVDFMembrane

作為PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為Immobilon-P

(0.45um),-PSQ(O.2um),-FL(用于熒光顯色)和BlottingSandwichesforHighTroughput

四種。Immobilon-P膜孔徑均一，具有極強的吸附力量，染色性能好、抗溶劑力量強和信噪

比高，有助于提高檢測靈敏度，而且開放的孔構造簡潔接近被吸附的蛋白質，并有助于去除背

景上沒有吸附的探針，可以說是免疫印跡檢測抱負的印跡膜。Immobilon-PSQ轉印膜是印跡小

分子蛋白質(<20KDa)的抱負選擇一一優(yōu)良的蛋白質吸附性能，滲漏少。內外表面積較大，

可供蛋白質吸附從而提高蛋白質測序的得率。由于不含污染性支撐物或外表活性劑，

Immobilon-PSQ層析譜上的背景峰值微小。Immobilon-FL也是Millipore值得傲慢的產品，

由于這是第一個特地為熒光顯色優(yōu)化的轉移膜。通過試驗證明，這種膜在Kodak成像系統(tǒng)可以

顯示僅7ng的蛋白，聽起來不錯吧，有興趣可以試一試。這幾種膜除了一般的PVDF膜的優(yōu)點

之外，最大特點就是一個字快。依據Millipore的操作手冊，Immobilon可以在保

證質量的前提下縮短福時間到2個小時一一主要是縮短封閉和洗脫時間。這可真是個好消息,

由于坐在那兒等WB結果多鋪張時間??！縮短這個費時而枯燥的過程，早出結果，可以提高試

驗效率，利于我們分析試驗結果，考慮下步對策嘛。卷膜經濟實惠，裁剪剩下的邊角料還可以

用來做點雜交，而預裁剪的即用膜更適合高通量等等''用金錢換時間”的試驗。再次強調的是,

疏水PVDF膜在用前必需經過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半

透亮后用MilliQ水或者純水漂洗一下，轉入電泳緩沖液平衡才能用。

Invitrogen公司的PVDF膜也有大家風范：膜是與兩張預裁的濾紙同時供給，便利使用；雖

然一般而言0.2um的膜滲漏少適用性會更強，但Invitrogen的0.45umPVDE膜自有自家優(yōu)

勢——特別適合于低背景，高敏感度的印跡反響，同樣需要在乙醇或者甲醇，或者異丙醇中浸

泡5分鐘就可以用了。

3.尼龍膜

尼龍膜更多是用于核酸的轉移，也有見于蛋白印跡，比方dotblot,比較于NC膜來說，

它的優(yōu)點是結合力強，特結實又松軟且不易卷曲，機械強度大，便于操作，缺點是背景高——由于

尼龍膜電荷密度高，使得非結合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對于靈敏度高的檢測方法，背

景問題尤為突出（據分子克隆HI說通過熱處理的酪蛋白和1%聚乙烯毗咯烷酮延長封閉時間

可以改善），而且當轉移緩沖液中存在有SDS時蛋白質就簡潔從尼龍膜上泄漏（通過甲醛固定

可以緩解這一狀況）。另外至今也沒有適合尼龍膜上的直接染色方法。因此在許多狀況下試

驗室人員進展邨試驗不選擇尼龍膜。

盡管如此，一些產品卻能“取其精華，去其糟粕”，將尼龍膜一些不利于蛋白印跡的因素

縮小或者去除，使其成為有效的蛋白轉移介質。比方說，化學發(fā)光底物做得相當精彩的

Pierce公司，其旗下的BiodyneA&BNylonTransferMembrane就是這樣一"^產品。這種

分為A,B兩型的尼龍膜做工精良，孔徑大小全都，為了保有尼龍膜高靈敏度的優(yōu)點和摒棄

背景影響大的缺點，Biodyne承受了適宜的signalto-noise比例來調整，從而到達了

200ug/cm2的蛋白結合力量，同時有比大多數尼龍膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此

之外，B型的Biodyne對于一些帶負電蛋白是一種抱負的轉移膜，由于它在A型的根底上提

高了正電荷集團的濃度。另外Biodyne相對于NC膜來說還是一種“打不怕，撕不爛，燒不

著（200℃一下）”的“堅韌”的轉移膜。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-）

A：實際操作

1.做膠前的預備

1）檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。

2）檢查是否有穎的，足量10%APS,沒有馬上重配。

3）按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分別膠各組分的用

量。

2.制膠，電泳

1）裝好架子。

2）依據下面配方配制分別膠。（單位:ml,Total：8ml）

7.5%10%15%

2XSep.buffer444

30%Gel.sol2.02.74

ddH201.91.20

TEMED8ul8ul8ul

10%APS80ul80ul80ul

在膠上面參加一層蒸鐲水，促進膠更好的凝集。

3）待分別膠凝集后，配制濃縮膠。（單位：ml,Total：3.5ml）

3%

2XStacking.buffer1.7

30%Gel.sol0.35

ddHO1.4

TEMED5ul

10%APS50ul

倒好后插入預先預備好的梳子。

4）待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當樣品至分別膠時，用100-120V

電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。

B：留意事項及常遇到的問題

1）分別膠不要倒的太滿，需要有肯定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。

2）上樣蛋白量不應超過30ug/nw（載荷面即：假設你的膠槽是5mmX1mm,則載荷面為：

ImmX5mm=5mm2）。

3）gel通常在0.5-lh內凝集最好，過快表示TEMED.APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，

而且電泳時簡潔燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或實效。

4）混合攪拌速度太快產生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。

5）電泳中常消滅的一些現象：

-條帶呈笑臉狀，緣由：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不適宜，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或

者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊集中：加樣量過多。

三、轉移

在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF

(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。有兩

種規(guī)格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)=

A半干法

馬上凝膠夾層組合放在吸有轉印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電

流，起到轉移的效果。由于電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移

時間短，效率高。

1試驗條件的選擇

電流lmA-2mA/cm2,我們通常100mA/膜，依據目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，

具體可以依據實際適當調整。

目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉移時間(h)

80——1408%1.5-2.0

25——80101.5

15—40120.75

<20150.5

2試驗操作

(1)濾紙和膜的預備(在電泳完畢前20分鐘應開頭預備工作)。

A.檢查是否有足夠的transferbuffer,沒有馬上配制。

B.檢查是否有適宜大小的濾紙和膜。

C.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transferbuffer中。

D.將適宜的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。

(2)轉移

A.在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B.將膜鋪在靠膜濾紙上，留意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到

膜上，保持膜的潮濕。

C.將膠剝出，去掉stackgel,留神的移到膜上。

D.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標記出膠的位置。

E.將一張靠膠濾紙掩蓋在膠上。倒上些transferbuffer,再鋪兩張靠膠濾紙。

F.裝好電轉移儀，依據需要選定所需的電流和時間。

G.轉移過程中要隨時觀看電壓的變化，如有特別應準時調整。

CATHODE(-)

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CathooeBufler

SDSgel

TrarsferMembrjMe

FilterPaper/

AnodeII

RltecPaper/

AnodeBirfterI

Fig.1.Semi-drytransle?stack0ssem附

3留意事項及常遇到的問題

1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙＞=膜＞=膠。

2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

3）由于膜的疏水性，膜必需首先在甲醛中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必需

隨時保持潮濕（干膜法除外）。

4）濾紙可以重復利用，上層濾紙（靠膜）內吸附有很多轉移透過的蛋白質，所以上下

濾紙肯定不能弄混，在不能區(qū)分的狀況下，可以將靠膠濾紙換的。

5）轉移時間一般為1.5小時，（1mA-2mA/cm2,10%gel）,可依據分子量大小調整轉移時間

和電流大小。

B濕法

我們根本上不用此方法，這里暫不做介紹。

C轉移后效果的鑒定

1.染膠

用考馬斯亮蘭染色經destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉移的效果。

2.染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不行逆的?？赡娴挠衟onceau-sred、FastgreenFC^CPTS

等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是不行逆的染料，

如考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就