WesternBlot技術(shù)專輯之PAGE膠電泳和轉(zhuǎn)膜

WesternBlot技術(shù)專輯之膠電泳和轉(zhuǎn)膜

倒膠的儀器我們?cè)谇懊鎃esternBlot儀器之選已經(jīng)介紹過(guò)了，除了順手的工具能防止漏

膠，配膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量固然有打算性的影響，這個(gè)配膠的比例，在

《分子克隆》上有具體的論述，信任大家都不難查到。簡(jiǎn)潔無(wú)視的問(wèn)題主要在于過(guò)硫酸錢

（AP）肯定要穎一一最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度,超過(guò)2周的AP扔掉算了,

或者己經(jīng)反復(fù)翻開(kāi)使用屢次的AP都別用，小氣病發(fā)作的后果往往是得不償失

一膠凝不好多半是這里疏忽（或者混合不勻），由于相對(duì)配膠的其他組分，AP算最活潑分

子一一假設(shè)還有諸如漏加某組分或者配比錯(cuò)誤或者Buffer搞錯(cuò)，那確定是你自己找罵，不

值得憐憫。水要用去離子的純水，MilliQ級(jí)更好。Cambrex（原來(lái)的FMC）有商品化的丙烯酰胺

母液，很貴，也很好一一配出的膠對(duì)200KD以上的蛋白的區(qū)分率高于一般膠，條帶清楚秀麗,

惋惜始終沒(méi)有搞清楚配方的奇特；但是數(shù)十倍于丙烯酰胺粉劑的價(jià)格令人卻步，不過(guò)，對(duì)接觸丙烯

酰胺粉塵嚴(yán)峻過(guò)敏的人可以選擇這個(gè)。更加豪華的選擇是已經(jīng)凝好的預(yù)制膠，各種配方各種

比例各種梳孔大小多少任君選擇，翻開(kāi)即用，固然更直接便利，更吸引人的是結(jié)果秀麗，區(qū)

分率高，特別是重復(fù)性好，條帶真正是“razorsharp”??！尋常都能用這么豪華的東西心情

固然超爽啊，試驗(yàn)緊湊又輕松，效率也更高啊！假照試驗(yàn)都能這么“好馬配好鞍”，想必更簡(jiǎn)

潔出結(jié)果，也就更簡(jiǎn)潔拿經(jīng)費(fèi)吧！什么時(shí)候我們的試驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)這種良性循環(huán)?。nvitrogen

旗下的Norvex和Cambrex（原來(lái)的FMC）r都是首選預(yù)制膠。可是在“社會(huì)主義初級(jí)階段”這

種鋪張品尋常流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了的優(yōu)待活動(dòng)，買3盒Nu預(yù)

制膠就送電泳儀或者電轉(zhuǎn)移，面對(duì)這種誘惑，你莫非就沒(méi)有一點(diǎn)非份之想的沖動(dòng)？

上樣電泳：上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過(guò)多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地

“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，依據(jù)說(shuō)明把握電流，不要過(guò)多重復(fù)使用電泳Buffer

（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖力量的），好似根本不會(huì)出問(wèn)題了。當(dāng)預(yù)染的Marker告知

你，你要區(qū)分的蛋白已經(jīng)到達(dá)最正確區(qū)分區(qū)一一分別膠的2/3處，0K,電泳完畢了。

電泳結(jié)果檢查：假設(shè)要做WesternBlot,是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何

再進(jìn)展下一步轉(zhuǎn)膜固然最好?？捡R斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以區(qū)分lug左右的條帶，是最經(jīng)

濟(jì)通用的蛋白膠電泳染色方法。銀染操作簡(jiǎn)單一些但區(qū)分率高很多，可以區(qū)分2-5ng蛋白。

可是由于考馬斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過(guò)固定不行逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的WesternBlot

試驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步一一同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以

說(shuō)明問(wèn)題。假設(shè)想在轉(zhuǎn)膜前看看電泳結(jié)果，你需要用SYPROTangerine——這種金色熒光蛋白

染料靈敏度很高一一檢測(cè)4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用格外簡(jiǎn)潔，最重要的是由于不用酸

堿或者有機(jī)溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉(zhuǎn)膜前的染色，或者非變性膠的活

性蛋白的檢測(cè)（比方染色后還需要在膠上進(jìn)展活性檢測(cè)等等）。惋惜SYPROTangerine價(jià)格

挺貴的，500ul（5000x）要2022元，即使很節(jié)約的用只夠或許100屢次呢。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠

的方法是：麗春紅S,直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗

春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。

轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過(guò)電泳分別后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過(guò)“轉(zhuǎn)膜”步驟一一從膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才

能用各種方法進(jìn)展WesternBlot的檢測(cè)和顯色，而且為了防止沒(méi)有電場(chǎng)的狀況下已經(jīng)分別

的蛋白條帶集中，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)展轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實(shí)就像是畫家在畫布

上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當(dāng)之重要。WesternBlotting亦

是如此，沒(méi)有選擇好適宜的轉(zhuǎn)移膜是無(wú)法做出秀麗的結(jié)果的。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)移膜，要

讓轉(zhuǎn)移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的試驗(yàn)。

WesternBlot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（NitrocelluloseBlotting

Membranes,NO和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）,此外也有用尼龍膜、DEAE纖

維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些試驗(yàn)?zāi)?？選擇的依據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子

的結(jié)合力量（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的

大小）；b.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.假設(shè)

后繼試驗(yàn)有其他要求，比方要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要依據(jù)不同目的來(lái)選擇不同的轉(zhuǎn)移

膜，就像國(guó)畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。

首先來(lái)比較下這幾種膜的特點(diǎn)

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靈敏度和分高高高

辨率

背景低較高低

125—200ug/cm2（適合于

結(jié)合力量80-110ug/cm2>400ug/cm2SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)

合）

材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實(shí)機(jī)械強(qiáng)度高

溶劑耐受性無(wú)無(wú)有

操作程序緩沖液潤(rùn)濕,避開(kāi)氣泡緩沖液潤(rùn)濕使用前100%甲醇潤(rùn)濕

常規(guī)染色，比較于NC膜，

常規(guī)染色，可用放射性和可用考馬斯亮藍(lán)染色，可

檢測(cè)方式不能用陰離子染料

非放射性檢測(cè)用于ECL檢測(cè)，快速免疫

檢測(cè)。

0.45um一般蛋白低濃度小分子蛋

0.2um一分子量小于20kD白、酸性蛋白、糖

適用范圍蛋白蛋白和蛋白多糖糖蛋白檢測(cè)和蛋白質(zhì)測(cè)序

0.lum一分子量小于7kD蛋（主要用在核酸檢

白測(cè)中）

價(jià)格價(jià)格較廉價(jià)廉價(jià)較貴

1.硝酸纖維素膜

硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合力量，而且適用于

各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景

低，信噪比高。NC膜的使用也很簡(jiǎn)便，比方不需要甲醛預(yù)處理，只要在無(wú)離子水面浸潤(rùn)排

出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比方NC膜很簡(jiǎn)潔封閉，也不需要特

別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，

Schleicher&Schull公司的一個(gè)試驗(yàn)說(shuō)明，轉(zhuǎn)移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5

年照舊保持免疫識(shí)別特性，照舊可以得到清楚可信的WesternBlot結(jié)果。不過(guò)要留意的是

純的硝纖膜在比較脆，又簡(jiǎn)潔卷，操作要留神，不適合用于需要屢次重復(fù)清洗的用途——因

為經(jīng)不起屢次“熬煎”。選擇硝纖膜時(shí)要留意的是選擇適宜的孔徑，通常20KD以上的大分

子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，假設(shè)小于7KD的話最好選擇

0.luni的膜。另外還要留意選擇純的NC膜一一混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結(jié)合力會(huì)有所

降低。另外提示一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)由于一些去污劑而被代替，因此在封閉時(shí)

最好使用較溫存的Tween20,而且濃度不要超過(guò)0.3%(據(jù)說(shuō)0.05%效果最好)。

硝纖膜最為大家生疏和認(rèn)可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL,另外

羅氏、Invitrogen、GE(Amersham)>SantaCruz等公司都有供給各式的硝纖膜(估量OEM

的可能性比較大，不過(guò)有時(shí)挺驚異的，OEM的有時(shí)比生產(chǎn)廠家賣的還廉價(jià))。Schleicher&

Schull的名字拗口一一那或許需要舌頭在口腔里經(jīng)過(guò)假設(shè)干次不同弧度和不同速度的上下來(lái)

回準(zhǔn)確運(yùn)動(dòng)再協(xié)作適當(dāng)?shù)耐職獠拍茏x得準(zhǔn)確優(yōu)雅，不過(guò)作為第一個(gè)供給硝纖膜的廠家照舊廣為

人知，其NC膜分為純NC膜和強(qiáng)化NC膜兩種：Protrannitrocellulosemembrane和

Optitrannitrocellulosemembrane。前者Protran始終是Schleicher&Schul1驕傲的產(chǎn)

品，這種a100%PureNitrocelluloseMembranes"。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合力

量就越高，所以要增加WB的靈敏度和區(qū)分率，提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。假

設(shè)NC膜攙雜一些醋化纖維素——這在前面己經(jīng)提到，會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)合。而Protran在制作過(guò)

程中去除了各種雜質(zhì)，保證了其純度，從而增加了蛋白結(jié)合力量。除了這一點(diǎn)以外，Protran還有

低背景、多孔徑選擇(0.45,0.2,0.lum)和保存時(shí)間長(zhǎng)(試驗(yàn)證明膜上蛋白識(shí)別時(shí)間可長(zhǎng)

達(dá)5年！真是“路遙知馬力”的典范)等優(yōu)點(diǎn)。但是Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械

耐受力欠佳，需要留神操作，假設(shè)擔(dān)憂自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或

者Pall公司的以耐受力著稱的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane,

Optitran是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，結(jié)果外表看

起來(lái)和純硝纖膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點(diǎn)，只是內(nèi)部多了一層中性支持物，大大增

加這種強(qiáng)化NC膜的柔韌度和機(jī)械耐受力，不簡(jiǎn)潔卷曲，便利操作，特別是重復(fù)標(biāo)記和洗脫

的試驗(yàn)。不過(guò)有的使用過(guò)的人反響不如純NC膜結(jié)合力量強(qiáng)。NC膜除了一般的Discs、Rolls

和Sheets以夕卜,像Invitrogen、Bio-Rad公司還有一種便利顧客使用的"sandwich”三明

治形，格外好玩。說(shuō)它好玩是由于考慮周到，利于高通量操作，但其實(shí)也就是將濾紙和NC

膜紙?zhí)壮蔀V紙一NC膜一濾紙的層迭形式，預(yù)先切割裝訂好，便利使用。不過(guò)，卷膜確定是

最實(shí)惠的選擇，只不過(guò)要自己動(dòng)手裁剪——切記，必需帶手套操作。不知道為什么在國(guó)外硝

纖膜會(huì)被當(dāng)作危急品來(lái)運(yùn)輸還要加收運(yùn)費(fèi)，所以貨期蠻長(zhǎng)的，所以還是卷膜好，一卷用n

年一一假設(shè)非要給這個(gè)n加個(gè)期限，那就是至少可以用到等我畢業(yè)之后。

2.PVDF膜

剛開(kāi)頭做WB的人或許會(huì)有這種疑問(wèn)：為什么試驗(yàn)室的教師（或者師兄師姐們）在教我們

做WB的時(shí)候，假設(shè)是用PVDF膜做，總是留神翼翼的剪，節(jié)約著用，甚至一些邊邊角角也舍

不得丟掉呢？其實(shí)，這不僅是由于PVDF膜比較貴，還由于PVDF膜是做WB的“殺手銅”。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore公司在1985年首先推出。與

硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留力量，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能

（Pluskal,etal.,1986）.市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80T00口g/cm2,而PVDF膜結(jié)

合量是100-200Mg/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍?。Ｔ诎滩《荆℉IV）血清

學(xué)檢驗(yàn)中直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更好的截留總HIV抗原力量并提高抗

體檢測(cè)糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)

耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為抱負(fù)選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)

本可用于多種目的，如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)展N-末端測(cè)序、蛋白消化/肽分別/

內(nèi)部測(cè)序和免疫檢測(cè)（Kurien,etal.,2022）?特別是需要做N端蛋白測(cè)序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷”

的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的狀況下PVDF膜照舊保持本色，笑傲江湖。所

以PVDF也是要做蛋白測(cè)序的唯一選擇。此外，個(gè)人閱歷，一些強(qiáng)疏水蛋白用PVDF膜效果會(huì)更

好一些。PVDF膜適用的檢測(cè)方法也不少，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一樣

0K,但不適合熒光。PVDF膜特別留意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過(guò)15秒）再用緩沖液

平衡，才能用，而且適用過(guò)程中萬(wàn)一干了也要同樣程序再處理（不過(guò)要真消滅這種問(wèn)題也是自

己欠扁，誰(shuí)要你不留神呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)

別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附,

背景可能會(huì)比前者稍高。

PVDF膜常見(jiàn)的有以下幾個(gè)品牌

口

公司產(chǎn)口口X名/孔徑適用范圍參考價(jià)格

MilliporeImmobilonTransfer0.45um$212

Membranes0.2urn

Bio-RadImmun-BlotPVDFChemiluminescent,

Membranecolorimetricwestern

blots,

amino-terminal

sequenceandtotal

aminoacid

composition

PiercePVDFMembrane0.45umWestern,Southern,

0.2umNorthern,anddot

blots

PallLifeBioTracePVDFTransfer0.45umNucleicacidand$149

ScienceMembraneproteintransfers.

Proteinsequencing

InvitrogenPVDFMembrane0.45umProteinsequencing,￥1625.8

0.2urnimmunoblotting

WhatmanWestranClearSignal0.45umWesternblots

PVDFMembrane

作為PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為Immobilon-P

(0.45um),-PSQ(O.2um),-FL(用于熒光顯色)和BlottingSandwichesforHighTroughput

四種。Immobilon-P膜孔徑均一，具有極強(qiáng)的吸附力量，染色性能好、抗溶劑力量強(qiáng)和信噪

比高，有助于提高檢測(cè)靈敏度，而且開(kāi)放的孔構(gòu)造簡(jiǎn)潔接近被吸附的蛋白質(zhì)，并有助于去除背

景上沒(méi)有吸附的探針，可以說(shuō)是免疫印跡檢測(cè)抱負(fù)的印跡膜。Immobilon-PSQ轉(zhuǎn)印膜是印跡小

分子蛋白質(zhì)(<20KDa)的抱負(fù)選擇一一優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能，滲漏少。內(nèi)外表面積較大，

可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測(cè)序的得率。由于不含污染性支撐物或外表活性劑，

Immobilon-PSQ層析譜上的背景峰值微小。Immobilon-FL也是Millipore值得傲慢的產(chǎn)品，

由于這是第一個(gè)特地為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。通過(guò)試驗(yàn)證明，這種膜在Kodak成像系統(tǒng)可以

顯示僅7ng的蛋白，聽(tīng)起來(lái)不錯(cuò)吧，有興趣可以試一試。這幾種膜除了一般的PVDF膜的優(yōu)點(diǎn)

之外，最大特點(diǎn)就是一個(gè)字快。依據(jù)Millipore的操作手冊(cè)，Immobilon可以在保

證質(zhì)量的前提下縮短福時(shí)間到2個(gè)小時(shí)一一主要是縮短封閉和洗脫時(shí)間。這可真是個(gè)好消息,

由于坐在那兒等WB結(jié)果多鋪張時(shí)間啊！縮短這個(gè)費(fèi)時(shí)而枯燥的過(guò)程，早出結(jié)果，可以提高試

驗(yàn)效率，利于我們分析試驗(yàn)結(jié)果，考慮下步對(duì)策嘛。卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，裁剪剩下的邊角料還可以

用來(lái)做點(diǎn)雜交，而預(yù)裁剪的即用膜更適合高通量等等''用金錢換時(shí)間”的試驗(yàn)。再次強(qiáng)調(diào)的是,

疏水PVDF膜在用前必需經(jīng)過(guò)50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半

透亮后用MilliQ水或者純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。

Invitrogen公司的PVDF膜也有大家風(fēng)范：膜是與兩張預(yù)裁的濾紙同時(shí)供給，便利使用；雖

然一般而言0.2um的膜滲漏少適用性會(huì)更強(qiáng)，但I(xiàn)nvitrogen的0.45umPVDE膜自有自家優(yōu)

勢(shì)——特別適合于低背景，高敏感度的印跡反響，同樣需要在乙醇或者甲醇，或者異丙醇中浸

泡5分鐘就可以用了。

3.尼龍膜

尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見(jiàn)于蛋白印跡，比方dotblot,比較于NC膜來(lái)說(shuō)，

它的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實(shí)又松軟且不易卷曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點(diǎn)是背景高——由于

尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對(duì)于靈敏度高的檢測(cè)方法，背

景問(wèn)題尤為突出（據(jù)分子克隆HI說(shuō)通過(guò)熱處理的酪蛋白和1%聚乙烯毗咯烷酮延長(zhǎng)封閉時(shí)間

可以改善），而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有SDS時(shí)蛋白質(zhì)就簡(jiǎn)潔從尼龍膜上泄漏（通過(guò)甲醛固定

可以緩解這一狀況）。另外至今也沒(méi)有適合尼龍膜上的直接染色方法。因此在許多狀況下試

驗(yàn)室人員進(jìn)展邨試驗(yàn)不選擇尼龍膜。

盡管如此，一些產(chǎn)品卻能“取其精華，去其糟粕”，將尼龍膜一些不利于蛋白印跡的因素

縮小或者去除，使其成為有效的蛋白轉(zhuǎn)移介質(zhì)。比方說(shuō)，化學(xué)發(fā)光底物做得相當(dāng)精彩的

Pierce公司，其旗下的BiodyneA&BNylonTransferMembrane就是這樣一"^產(chǎn)品。這種

分為A,B兩型的尼龍膜做工精良，孔徑大小全都，為了保有尼龍膜高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)和摒棄

背景影響大的缺點(diǎn)，Biodyne承受了適宜的signalto-noise比例來(lái)調(diào)整，從而到達(dá)了

200ug/cm2的蛋白結(jié)合力量，同時(shí)有比大多數(shù)尼龍膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此

之外，B型的Biodyne對(duì)于一些帶負(fù)電蛋白是一種抱負(fù)的轉(zhuǎn)移膜，由于它在A型的根底上提

高了正電荷集團(tuán)的濃度。另外Biodyne相對(duì)于NC膜來(lái)說(shuō)還是一種“打不怕，撕不爛，燒不

著（200℃一下）”的“堅(jiān)韌”的轉(zhuǎn)移膜。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-）

A：實(shí)際操作

1.做膠前的預(yù)備

1）檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。

2）檢查是否有穎的，足量10%APS,沒(méi)有馬上重配。

3）按將要檢測(cè)的抗體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出分別膠各組分的用

量。

2.制膠，電泳

1）裝好架子。

2）依據(jù)下面配方配制分別膠。（單位:ml,Total：8ml）

7.5%10%15%

2XSep.buffer444

30%Gel.sol2.02.74

ddH201.91.20

TEMED8ul8ul8ul

10%APS80ul80ul80ul

在膠上面參加一層蒸鐲水，促進(jìn)膠更好的凝集。

3）待分別膠凝集后，配制濃縮膠。（單位：ml,Total：3.5ml）

3%

2XStacking.buffer1.7

30%Gel.sol0.35

ddHO1.4

TEMED5ul

10%APS50ul

倒好后插入預(yù)先預(yù)備好的梳子。

4）待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分別膠時(shí)，用100-120V

電壓。一般電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。

B：留意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題

1）分別膠不要倒的太滿，需要有肯定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。

2）上樣蛋白量不應(yīng)超過(guò)30ug/nw（載荷面即：假設(shè)你的膠槽是5mmX1mm,則載荷面為：

ImmX5mm=5mm2）。

3）gel通常在0.5-lh內(nèi)凝集最好，過(guò)快表示TEMED.APS用量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易龜裂，

而且電泳時(shí)簡(jiǎn)潔燒膠。太慢則說(shuō)明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或?qū)嵭А?/p>

4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。

5）電泳中常消滅的一些現(xiàn)象：

-條帶呈笑臉狀，緣由：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不適宜，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或

者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊集中：加樣量過(guò)多。

三、轉(zhuǎn)移

在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF

(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩

種規(guī)格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)=

A半干法

馬上凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過(guò)濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電

流，起到轉(zhuǎn)移的效果。由于電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移

時(shí)間短，效率高。

1試驗(yàn)條件的選擇

電流lmA-2mA/cm2,我們通常100mA/膜，依據(jù)目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，

具體可以依據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。

目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉(zhuǎn)移時(shí)間(h)

80——1408%1.5-2.0

25——80101.5

15—40120.75

<20150.5

2試驗(yàn)操作

(1)濾紙和膜的預(yù)備(在電泳完畢前20分鐘應(yīng)開(kāi)頭預(yù)備工作)。

A.檢查是否有足夠的transferbuffer,沒(méi)有馬上配制。

B.檢查是否有適宜大小的濾紙和膜。

C.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transferbuffer中。

D.將適宜的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。

(2)轉(zhuǎn)移

A.在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B.將膜鋪在靠膜濾紙上，留意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到

膜上，保持膜的潮濕。

C.將膠剝出，去掉stackgel,留神的移到膜上。

D.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。

E.將一張靠膠濾紙掩蓋在膠上。倒上些transferbuffer,再鋪兩張靠膠濾紙。

F.裝好電轉(zhuǎn)移儀，依據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。

G.轉(zhuǎn)移過(guò)程中要隨時(shí)觀看電壓的變化，如有特別應(yīng)準(zhǔn)時(shí)調(diào)整。

CATHODE(-)

F#efPaper/

CathooeBufler

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TrarsferMembrjMe

FilterPaper/

AnodeII

RltecPaper/

AnodeBirfterI

Fig.1.Semi-drytransle?stack0ssem附

3留意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題

1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙＞=膜＞=膠。

2）濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。

3）由于膜的疏水性，膜必需首先在甲醛中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必需

隨時(shí)保持潮濕（干膜法除外）。

4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過(guò)的蛋白質(zhì)，所以上下

濾紙肯定不能弄混，在不能區(qū)分的狀況下，可以將靠膠濾紙換的。

5）轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為1.5小時(shí)，（1mA-2mA/cm2,10%gel）,可依據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間

和電流大小。

B濕法

我們根本上不用此方法，這里暫不做介紹。

C轉(zhuǎn)移后效果的鑒定

1.染膠

用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來(lái)反映轉(zhuǎn)移的效果。

2.染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不行逆的。可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC^CPTS

等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不行逆的染料，

如考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就