分子生物學(xué)的研究技術(shù)(理論)

分子生物學(xué)的研究技術(shù)(理論)一般認(rèn)為1973年是基因工程誕生的元年。上世紀(jì)40年代——70年代初分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明對(duì)于基因工程的誕生起到了決定性的作。第一節(jié)基因工程的誕生1944年，AveryO.T.利用肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1、DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí)理論上的三大發(fā)現(xiàn)40年代，證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)

早在上世紀(jì)20年代，已經(jīng)知道染色體由DNA和組蛋白構(gòu)成，但組成蛋白的氨基酸有20種，而組成DNA的核苷酸只有4種，什么是遺傳物質(zhì)？1928年，英國微生物學(xué)家F.Griffith著名的肺炎雙球菌感染小白鼠實(shí)驗(yàn)。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加熱：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加熱S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠體內(nèi)得到了S型菌。

40年代，DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí)1944年，美國洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公開發(fā)表了改進(jìn)的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（1）S型菌無細(xì)胞提取物及其純化的DNA都可使R型菌轉(zhuǎn)變成S型菌；（2）經(jīng)DNase處理的S型菌無細(xì)胞提取物失去了轉(zhuǎn)化作用。（3）經(jīng)胰蛋白酶處理的S型菌無細(xì)胞提取物仍有轉(zhuǎn)化作用。不僅證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì)，而且證明了DNA可以將一個(gè)細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)給另一個(gè)細(xì)菌，他的工作被稱為是現(xiàn)代生物科學(xué)的革命性開端。Watson和Crick2、DNA雙螺旋模型的提出50年代，DNA的雙螺旋模型的提出和DNA復(fù)制機(jī)理的闡明

DNA是遺傳物質(zhì)已被證實(shí)，但是DNA是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細(xì)胞增殖過程中，DNA是怎樣復(fù)制的？因此，對(duì)于DNA結(jié)構(gòu)的研究成為了當(dāng)時(shí)生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)。1953年，F(xiàn)rancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的資料，提出了DNA的雙螺旋模型。隨后，DNA的半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制機(jī)理也被闡明，為基因工程的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

Nireberg等為代表的一批科學(xué)家3、“中心法則”的提出60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

既然，DNA是遺傳信息的載體，那么它是如何傳遞遺傳信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家經(jīng)過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸，到1966年，全部破譯了64個(gè)密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII，1972年，Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了ＥcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。

1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用技術(shù)上的三大發(fā)明1967年，世界上又五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。2、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用1972年，美國Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組；3、載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用1973年，Stanford大學(xué)的Cohen等成功地利用體外重組實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這一年被定為基因工程誕生的元年。3、載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用Cohen等的重組實(shí)驗(yàn)示意圖TcrNerEcoRIEcoRI連接酶TcrNer雙抗重組菌落基因工程發(fā)展史上首次實(shí)現(xiàn)了重組DNA的細(xì)菌轉(zhuǎn)化基因工程研究的基本步驟1、從生物體中分離得到目的基因（或DNA片段）2、在體外，將目的基因插入能自我復(fù)制的載體中得到重組DNA分子。3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并進(jìn)行繁殖。4、選擇得到含有重組DNA分子的細(xì)胞克隆，并進(jìn)行大量繁殖，從而使得目的基因得到擴(kuò)增。5、進(jìn)一步對(duì)獲得的目的基因進(jìn)行研究和利用。比如，序列分析、表達(dá)載體構(gòu)建、原核表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因研究和利用等。基因工程的基本流程基因分離酶切載體酶切基因和載體連接導(dǎo)入細(xì)菌重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達(dá)等研究導(dǎo)入植物細(xì)胞第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性3、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)1000bp不是無用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點(diǎn)及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3’端24-26bp處是有用限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichiacoli表示為Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示為

Hin；2、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如EcoRI、HindIII。II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性每種酶都有其特定的DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識(shí)別序列的對(duì)稱性靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點(diǎn)旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端cohesiveends因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對(duì)稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很容易通過互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來。平末端Bluntend因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來。幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

一個(gè)酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，50L反應(yīng)體系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A.DNA的純度和甲基化程度B.甘油的含量（不超過5%）C.反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度D.反應(yīng)體系的pH值F.反應(yīng)的溫度條件（通常為37℃）酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L酶切反應(yīng)的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT1、DNA連接酶作用的特點(diǎn)2、DNA連接酶的反應(yīng)條件第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用DNA連接酶作用的特點(diǎn)A.連接的兩條鏈必須分別具有3′端自由羥基（-OH）和5′端磷酸基團(tuán)（-P），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)才能進(jìn)行連接反應(yīng)；B.在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程，因此連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。OKNODNA連接反應(yīng)的條件連接反應(yīng)最佳溫度為37℃，但是此時(shí)粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會(huì)迅速降低。比如，EcoRI粘性末端連接部位只有4個(gè)堿基對(duì)，很容易斷開。所以通常在4-16℃連接。影響連接效率的因素有：A.溫度（最主要的因素）B.ATP的濃度(10M-1M)C.連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.反應(yīng)時(shí)間（通常連接過夜）E.插入片段和載體片段的摩爾比轉(zhuǎn)化4℃過夜加反應(yīng)液CK-重組菌落CK+粘性末端DNA片段的連接NickNick1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

大腸桿菌DNA聚合酶I（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先從大腸桿菌E。Coli細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引物的3′末端，并不斷延伸。5′-3′外切酶活性將雙鏈DNA中游離的5′末端逐個(gè)切去。3′-5′外切酶活性將游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對(duì)于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用

Klenow片段的主要用途Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端標(biāo)記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測(cè)定GAACTTAA第三章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第四節(jié)人工染色體載體（B/Y/HAC）引言基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實(shí)現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)；具有1-2個(gè)選擇標(biāo)記基因，如對(duì)抗生素的抗性基因等；具備多克隆位點(diǎn)（MCS），而且可攜帶外源DNA片段的長度范圍較寬。自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene第三章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第四節(jié)人工染色體載體（B/Y/HAC）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）1、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。（3）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存。比如，對(duì)抗菌素的抗性，對(duì)重金屬的抗性等。1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigentplasmid）,拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為10-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的變化。（5）質(zhì)粒的不親和性兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（6）質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）第一節(jié)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）1、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹質(zhì)粒：是一種裸露的雙鏈閉環(huán)DNA分子，它們?cè)诩闹骷?xì)胞中能夠獨(dú)立地自我復(fù)制從而得到不斷的繁殖。作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分。多克隆位點(diǎn)：克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選自得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。（1）-互補(bǔ)

(alpha-complementation)大腸桿菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ

基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是alpha-complementation.2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導(dǎo)物IPTG的平板上分辨出來。因?yàn)檫@類菌落中釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別。2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹（2）PBR322Thisisoneoftheearliestgeneralpurposecloningvectorstobedeveloped.Itisa4363bpplasmidwithtwoantibioticresistancegenes,foricillinandtetracycline.Thereareseveraluniquerestrictionsites.pBR322generallydoesnotgivesuchahighyieldofplasmidDNAasmodernvectorssuchaspUC,pGEMandpBluescript2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹pBR3224363連接加反應(yīng)液TetorAmpTet+AmpCK+2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹思考題什么是限制性核酸內(nèi)切酶，它們是怎樣命名的？II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性有哪些？什么是粘性末端、平末端？酶的單位是怎樣定義的，影響酶活性的因素有哪些？DNA連接酶的作用特點(diǎn)有哪些？大腸桿菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用價(jià)值。Klenow片段和大腸桿菌DNA聚合酶I有何異同？基因克隆的載體必須具備哪些特性？質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性有哪些？第四章PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25