生物信息的傳遞(上)

1、什么是DNA的半保留復(fù)制？2、DNA復(fù)制的生物學(xué)意義是什么？3、原核生物中主要有那幾種DNA聚合酶？請說出它們的主要功能？4、說出人類細胞中最大的和最小的染色體，它們各有多少bp。本文檔共133頁；當前第1頁；編輯于星期二\3點7分5、說出DNA作為遺傳物質(zhì)的最基本特征。6、有什么證據(jù)說明染色體可能是由核小體組成的？7、大腸桿菌DNA完全伸展時有多長？8、重疊基因是怎樣發(fā)現(xiàn)的，是從哪種生物里首次發(fā)現(xiàn)的？本文檔共133頁；當前第2頁；編輯于星期二\3點7分3生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA本文檔共133頁；當前第3頁；編輯于星期二\3點7分主要內(nèi)容轉(zhuǎn)錄的基本過程轉(zhuǎn)錄機器的主要成分啟動子和轉(zhuǎn)錄起始原核和真核生物mRNA的特征比較終止和抗終止內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼及化學(xué)修飾本文檔共133頁；當前第4頁；編輯于星期二\3點7分基因作為唯一能夠自主復(fù)制、永久存在的單位，其生物學(xué)功能是以RNA或蛋白質(zhì)的形式表達出來的。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復(fù)制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成信使RNA，翻譯生成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象。本文檔共133頁；當前第5頁；編輯于星期二\3點7分基因表達包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之外）的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。本文檔共133頁；當前第6頁；編輯于星期二\3點7分DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控制了細胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。本文檔共133頁；當前第7頁；編輯于星期二\3點7分FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right)本文檔共133頁；當前第8頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第9頁；編輯于星期二\3點7分與mRNA序列相同的那條DNA鏈是編碼鏈（codingstrand）或稱有意義鏈（sensestrand），另一條根據(jù)堿基互補原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈則被稱為模板鏈（templatestrand）或稱反義鏈（antisensestrand）。本文檔共133頁；當前第10頁；編輯于星期二\3點7分DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系本文檔共133頁；當前第11頁；編輯于星期二\3點7分DNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它們既擔負著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。本文檔共133頁；當前第12頁；編輯于星期二\3點7分因為只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。本文檔共133頁；當前第13頁；編輯于星期二\3點7分生物體內(nèi)擁有三類RNA，即：編碼特定蛋白質(zhì)序列的mRNA；能特異性解讀mRNA中的遺傳信息并將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后加入多肽鏈中的tRNA；直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成的rRNA。本文檔共133頁；當前第14頁；編輯于星期二\3點7分3.1RNA轉(zhuǎn)錄過程無論是原核還是真核細胞，轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：

模板識別

轉(zhuǎn)錄起始

通過啟動子

轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的終止本文檔共133頁；當前第15頁；編輯于星期二\3點7分大腸桿菌中依賴于DNA的RNA轉(zhuǎn)錄過程圖示。轉(zhuǎn)錄泡中單鏈DNA的長度約在17bp左右，被聚合酶復(fù)合物所保護的DNA序列約為35bp左右。本文檔共133頁；當前第16頁；編輯于星期二\3點7分3.1.1模板識別

模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。啟動子（promoter）是基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列，是基因表達調(diào)控的上游順式作用元件。本文檔共133頁；當前第17頁；編輯于星期二\3點7分真核生物RNA聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū)，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定順序結(jié)合于啟動子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物（preinitiationtranscriptioncomplex,PIC），以保證有效地起始轉(zhuǎn)錄。本文檔共133頁；當前第18頁；編輯于星期二\3點7分3.1.2轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始不需要引物，啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。本文檔共133頁；當前第19頁；編輯于星期二\3點7分轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始。本文檔共133頁；當前第20頁；編輯于星期二\3點7分一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進入正常的延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。一般說來，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。本文檔共133頁；當前第21頁；編輯于星期二\3點7分3.1.3轉(zhuǎn)錄延伸RNA聚合酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動，DNA雙螺旋持續(xù)解開，暴露出新的單鏈DNA模板，新生RNA鏈的3’末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。本文檔共133頁；當前第22頁；編輯于星期二\3點7分3.1.4轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄到終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA聚合物分離，DNA恢復(fù)，RNA及RNA聚合酶釋放。37℃時，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度大約是每分鐘2500個核苷酸，即每秒鐘合成14個密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個氨基酸。正常情況下，從一個基因開始表達到細胞中出現(xiàn)其mRNA的間隔約為2.5分鐘，而再過半分鐘就能在細胞內(nèi)測到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。本文檔共133頁；當前第23頁；編輯于星期二\3點7分3.2轉(zhuǎn)錄機器的主要成分3.2.1RNA聚合酶RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以4種核苷三磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈相互補的RNA。本文檔共133頁；當前第24頁；編輯于星期二\3點7分RNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板。原核和真核生物的RNA聚合酶雖然都能催化RNA的合成，但在其分子組成、種類和生化特性上各有特色。本文檔共133頁；當前第25頁；編輯于星期二\3點7分1.原核生物的RNA聚合酶大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌聚合酶由2個α亞基、一個β亞基、一個β’亞基和一個ω亞基組成，稱為核心酶。加上一個σ亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對分子質(zhì)量為4.65×105。本文檔共133頁；當前第26頁；編輯于星期二\3點7分大腸桿菌RNA聚合酶的主要成分本文檔共133頁；當前第27頁；編輯于星期二\3點7分大腸桿菌RNA聚合酶的主要成分本文檔共133頁；當前第28頁；編輯于星期二\3點7分表3-1大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量*104亞基數(shù)組分功能αrpoA3.652核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB15.11核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心β’rpoC15.51核心酶ω111核心酶未知σrpoD71σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子本文檔共133頁；當前第29頁；編輯于星期二\3點7分α亞基可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。T4噬菌體感染大腸桿菌后對α亞基的一個精氨酸殘基進行ADP糖基化修飾，造成RNA聚合酶全酶對啟動子親和力降低。本文檔共133頁；當前第30頁；編輯于星期二\3點7分由β和β’亞基組成了聚合酶的催化中心，它們在序列上與真核生物RNA聚合酶的兩個大亞基有同源性。β亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。本文檔共133頁；當前第31頁；編輯于星期二\3點7分σ因子的作用是負責模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模板上的啟動子。核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個結(jié)合位點，平均結(jié)合常數(shù)為2×1011。本文檔共133頁；當前第32頁；編輯于星期二\3點7分σ因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達數(shù)小時甚至數(shù)十小時。σ因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底復(fù)合物的半衰期小于1秒。本文檔共133頁；當前第33頁；編輯于星期二\3點7分表3-2大腸桿菌中的σ因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結(jié)合因子基因功能-35區(qū)間隔bp-10區(qū)σ70ropD廣泛TTGACA16-18TATAATσ32ropH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54ropN氮代謝CTGGNA6TTGCA本文檔共133頁；當前第34頁；編輯于星期二\3點7分枯草桿菌中有6種不同相對分子質(zhì)量的σ因子，其中σ55是主要存在形式，出現(xiàn)在營養(yǎng)細胞中，σ29則主要出現(xiàn)在胞子形成階段，參與胞子形成期基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。在大腸桿菌中，最常見的調(diào)控因子是由rpoD基因所編碼的σ70。本文檔共133頁；當前第35頁；編輯于星期二\3點7分由rpoH編碼的σ32是與熱休克啟動子所控制的基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。由rpoN編碼的σ54則參與細胞的氮代謝。由T4噬菌體所編碼的σ55能與大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，啟動T4晚期基因的轉(zhuǎn)錄。本文檔共133頁；當前第36頁；編輯于星期二\3點7分2.真核生物RNA聚合酶真核生物中有3類RNA聚合酶，其結(jié)構(gòu)比大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)雜，它們在細胞核中的位置不同，負責轉(zhuǎn)錄的基因不同，對α-鵝膏覃堿的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個亞基所組成，相對分子質(zhì)量超過5×105。本文檔共133頁；當前第37頁；編輯于星期二\3點7分真核生物RNA聚合酶的主要特征：聚合酶中有兩個相對分子質(zhì)量超過1×105的大亞基；同種生物3類聚合酶有“共享”小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。本文檔共133頁；當前第38頁；編輯于星期二\3點7分表3-3真核細胞中三類RNA聚合酶特性比較酶定位產(chǎn)物相對活性對α-鵝膏覃堿的敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA50%~70%不敏感RNA聚合酶II核質(zhì)hnRNA20%~40%敏感RNA聚合酶III核質(zhì)tRNA約10%物種特異性本文檔共133頁；當前第39頁；編輯于星期二\3點7分3.2.2轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closedcomplex，此時，DNA仍處于雙鏈狀態(tài)）。然后，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開放復(fù)合物（opencomplex），聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。對于強啟動子來說，從封閉復(fù)合物到開放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。本文檔共133頁；當前第40頁；編輯于星期二\3點7分RNA合成的起始本文檔共133頁；當前第41頁；編輯于星期二\3點7分開放復(fù)合物與最初的兩個NTP相結(jié)合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復(fù)合物。除RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與。本文檔共133頁；當前第42頁；編輯于星期二\3點7分一般情況下，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以進入兩條不同的反應(yīng)途徑：合成并釋放2-9個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；盡快釋放σ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。本文檔共133頁；當前第43頁；編輯于星期二\3點7分轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物較為穩(wěn)定，可長時間與DNA模板結(jié)合而不解離。只有在遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從模板DNA上脫落。本文檔共133頁；當前第44頁；編輯于星期二\3點7分3.3啟動子與轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始是基因表達的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動子的相互作用。啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因表達的水平。本文檔共133頁；當前第45頁；編輯于星期二\3點7分大腸桿菌RNA聚合酶與啟動子的相互作用主要包括啟動子區(qū)的識別、酶與啟動子的結(jié)合及σ因子的結(jié)合與解離。本文檔共133頁；當前第46頁；編輯于星期二\3點7分3.3.1啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。本文檔共133頁；當前第47頁；編輯于星期二\3點7分轉(zhuǎn)錄單元（transcriptionunit）是一段從啟動子開始至終止子（terminator）結(jié)束的DNA序列。本文檔共133頁；當前第48頁；編輯于星期二\3點7分轉(zhuǎn)錄起點是指與新生RNA鏈第一個核苷酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基，通常為嘌呤。把起點5'末端的序列稱為上游（upstream），而把其3'末端的序列稱為下游(downstream)。起點為+1，下游方向依次為+2、+3……等，上游方向依次為–1、–2、–3……等等。本文檔共133頁；當前第49頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第50頁；編輯于星期二\3點7分啟動子區(qū)結(jié)構(gòu)特點Pribnow將RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44個核苷酸對的DNA片段。序列分析發(fā)現(xiàn)，在被保護區(qū)內(nèi)有一個由5個核苷酸組成的保守序列，是聚合酶結(jié)合位點，稱為Pribnow區(qū)，其中央大約位于起點上游10bp處，所以又稱為-10區(qū)。本文檔共133頁；當前第51頁；編輯于星期二\3點7分分離轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列程序圖本文檔共133頁；當前第52頁；編輯于星期二\3點7分科學(xué)家又從噬菌體的左、右啟動子PL及PR和SV40啟動子的-35bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。現(xiàn)已證實大部分啟動子都存在這兩段共同序列，即位于-10bp處的TATA區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)，它們是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點。本文檔共133頁；當前第53頁；編輯于星期二\3點7分大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)本文檔共133頁；當前第54頁；編輯于星期二\3點7分–35區(qū)–10區(qū)…T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100…在真核生物基因中，Hogness等發(fā)現(xiàn)類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)，在轉(zhuǎn)錄起始點上游-25～-30bp處，保守序列為TATAAA，也稱TATA區(qū)。在起始位點上游-70～-78bp處還有另一段共同序列CCAAT，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。本文檔共133頁；當前第55頁；編輯于星期二\3點7分真核基因的啟動子在–25～–35區(qū)含有TATA序列，在–70～–80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。習慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件（upstreampromoterelement，UPE）或稱上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS）。本文檔共133頁；當前第56頁；編輯于星期二\3點7分如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會使該啟動子發(fā)生下降突變；如果增加Pribnow區(qū)的共同序列，將乳糖操縱子的啟動子中的TATGTT變成TATATT，就會提高啟動子的效率，稱為上升突變。3.3.2啟動子區(qū)及上游序列作用本文檔共133頁；當前第57頁；編輯于星期二\3點7分TATA區(qū)的作用TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始。如果除去TATA區(qū)或進行堿基突變，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始點不固定。本文檔共133頁；當前第58頁；編輯于星期二\3點7分CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT區(qū)，只有6個串聯(lián)在上游–40～–110位點的GC區(qū)；而組蛋白H2B，不含GC區(qū)，但有兩個CAAT區(qū)，一個TATA區(qū)。CAAT和GC區(qū)的作用本文檔共133頁；當前第59頁；編輯于星期二\3點7分真核細胞中的部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分析本文檔共133頁；當前第60頁；編輯于星期二\3點7分上游激活序列作用研究SV40晚期基因啟動子發(fā)現(xiàn)，上游激活區(qū)的存在與否，對該啟動子的生物活性有著根本性的影響。若將該基因5'上游-21～-47核苷酸序列切除，基因完全不表達。本文檔共133頁；當前第61頁；編輯于星期二\3點7分3.3.3RNA聚合酶與啟動子區(qū)的結(jié)合聚合酶首先與啟動子區(qū)閉合雙鏈DNA結(jié)合，形成閉合復(fù)合物，經(jīng)解鏈得到開鏈復(fù)合物。解鏈區(qū)一般在-9~+13，酶與啟動子結(jié)合在其上游。RNA聚合酶即是雙鏈DNA結(jié)合蛋白又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。本文檔共133頁；當前第62頁；編輯于星期二\3點7分3.3.4增強子及其功能在SV40的轉(zhuǎn)錄單元上發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點上游約200bp處有兩段72bp長的重復(fù)序列，它們不是啟動子的一部分，但能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始，因此，稱這種能強化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強子或強化子（enhancer）。本文檔共133頁；當前第63頁；編輯于星期二\3點7分遠距離效應(yīng)無方向性順式調(diào)節(jié)無物種、基因特異性組織特異性相位性對外應(yīng)答(部分)本文檔共133頁；當前第64頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第65頁；編輯于星期二\3點7分3.3.5轉(zhuǎn)錄抑制DNA模版抑制劑放線菌素DRNA聚合酶抑制物利福霉素、利迪鏈霉素、α-鵝膏蕈堿本文檔共133頁；當前第66頁；編輯于星期二\3點7分表轉(zhuǎn)錄的抑制劑抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細菌全酶和β亞基結(jié)合，抑制起始利迪鏈霉素細菌核心酶和β亞基結(jié)合，抑制起始放線菌素D真核PolⅠ和DNA結(jié)合，阻止延伸α-鵝膏蕈堿真核PolⅡ和RNAPolⅡ結(jié)合本文檔共133頁；當前第67頁；編輯于星期二\3點7分3.4原核與真核生物mRNA的特征比較mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總RNA的2%左右，tRNA占16%，rRNA則占80%以上。真核細胞的mRNA往往以較大相對分子量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進入細胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細胞mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。本文檔共133頁；當前第68頁；編輯于星期二\3點7分3.4.1原核生物mRNA的特征1.半衰期短原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯是在同一個細胞空間里同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。本文檔共133頁；當前第69頁；編輯于星期二\3點7分53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象（電鏡模擬圖）核糖體RNARNA聚合酶本文檔共133頁；當前第70頁；編輯于星期二\3點7分大多數(shù)細菌mRNA在轉(zhuǎn)錄開始1分鐘后就開始降解。降解的速度大概只有轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)每過大約2分鐘，體系中出現(xiàn)新生蛋白質(zhì)的速度就下降50%。本文檔共133頁；當前第71頁；編輯于星期二\3點7分2.原核細胞的mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽，而真核細胞的mRNA最多只能編碼一個多肽。把只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA(monocistronicmRNA)，把編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA(polycistronicmRNA)。本文檔共133頁；當前第72頁；編輯于星期二\3點7分幾乎所有mRNA都可以被分成3部分：編碼區(qū)和位于AUG之前的5’端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3’端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開始經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。本文檔共133頁；當前第73頁；編輯于星期二\3點7分第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始。前一個多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基也可能不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動第二個多肽的合成。本文檔共133頁；當前第74頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第75頁；編輯于星期二\3點7分一個順反子的翻譯有時完全取決于它前面順反子的翻譯，因為只有第一個翻譯起始位點是暴露的，在這個順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運動破壞了后續(xù)順反子的二級結(jié)構(gòu)，使起始位點較容易與核糖體相結(jié)合形成起復(fù)合物。本文檔共133頁；當前第76頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第77頁；編輯于星期二\3點7分3.原核生物mRNA的5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的多聚A結(jié)構(gòu)。原核生物起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine–Dalgarnosequence）的保守區(qū)，因為該序列與16S-rRNA3’端反向互補，所以被認為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。本文檔共133頁；當前第78頁；編輯于星期二\3點7分4.原核生物常以AUG（有時GUG，甚至UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠以AUG作為起始密碼子。本文檔共133頁；當前第79頁；編輯于星期二\3點7分3.4.2真核生物mRNA的特征編碼功能蛋白的真核基因都通過RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄，幾乎都是單順反子，其長度在幾百到幾千個核苷酸之間。一個完整的基因，不但包括編碼區(qū)（codingregion），還包括5'和3'端長度不等的特異性序列，它們雖然不編碼氨基酸，卻在基因表達的過程中起著重要作用。本文檔共133頁；當前第80頁；編輯于星期二\3點7分“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。真核生物mRNA結(jié)構(gòu)上的最大特征是5’端的帽子及3’的多聚(A)結(jié)構(gòu)。Agenecanbedefinedasfollowing:TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.本文檔共133頁；當前第81頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第82頁；編輯于星期二\3點7分1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄一般從嘌呤（主要是A，也可能是G）起始，其5’端大都經(jīng)過修飾，第一個核苷酸保留了5’端的三磷酸基團。本文檔共133頁；當前第83頁；編輯于星期二\3點7分用核酸酶處理成熟mRNA，其5’端并不產(chǎn)生預(yù)期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以5’-5’三磷酸基團相連的二核苷酸。5’端是一個在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥嘌呤。本文檔共133頁；當前第84頁；編輯于星期二\3點7分mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個甲基出現(xiàn)在所有真核細胞的mRNA中（單細胞真核生物mRNA主要是這個結(jié)構(gòu)），由尿苷酸-7甲基轉(zhuǎn)移酶催化，稱為零類帽子（cap0）。本文檔共133頁；當前第85頁；編輯于星期二\3點7分如在第二個核苷酸(原mRNA5’第一位)的2’-OH位上加另一個甲基，這步反應(yīng)由2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶完成。一般把有這兩個甲基的結(jié)構(gòu)稱為1類帽子（cap1），真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。當mRNA原第一位核苷酸是A時，其N6位有時也被甲基化，這一反應(yīng)只能在2’-OH被甲基化以后才能發(fā)生。本文檔共133頁；當前第86頁；編輯于星期二\3點7分在某些生物細胞內(nèi)，mRNA鏈上的原第二個核苷酸的2’-OH位也可能被甲基化，因為這個反應(yīng)只以帶有1類帽子的mRNA為底物，所以被稱為2類帽子（cap2）。有2類帽子的mRNA只占有帽mRNA總量的10%-15%以下。本文檔共133頁；當前第87頁；編輯于星期二\3點7分真核生物5’末端帽結(jié)構(gòu)類型cap0,cap1andcap2本文檔共133頁；當前第88頁；編輯于星期二\3點7分cap0cap1cap2cap1cap2本文檔共133頁；當前第89頁；編輯于星期二\3點7分2.絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚A尾巴除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有多聚A序列，其長度因mRNA種類不同而變化，一般為40-200個左右。本文檔共133頁；當前第90頁；編輯于星期二\3點7分真核基因的3'末端轉(zhuǎn)錄終止位點上游15～30bp處的保守序列AAUAAA對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準確切割及加多聚A是必需的。本文檔共133頁；當前第91頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第92頁；編輯于星期二\3點7分多聚A是mRNA由細胞核進入細胞質(zhì)所必需的形式，它大大提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛從細胞核進入細胞質(zhì)時，其多聚A尾巴一般比較長，隨著mRNA在細胞質(zhì)內(nèi)逗留時間延長，多聚A逐漸變短消失，mRNA進入降解過程。本文檔共133頁；當前第93頁；編輯于星期二\3點7分3.5終止和抗終止RNA聚合酶啟始基因轉(zhuǎn)錄后，就沿模板5’→3’方向不停地移動，合成RNA鏈直到碰上終止信號時才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都被破壞，模板DNA鏈與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。本文檔共133頁；當前第94頁；編輯于星期二\3點7分3.5.1不依賴于ρ因子的終止終止位點上游一般有一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)。在模版鏈終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。本文檔共133頁；當前第95頁；編輯于星期二\3點7分5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGGCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)本文檔共133頁；當前第96頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第97頁；編輯于星期二\3點7分新生RNA中出現(xiàn)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5’端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3’端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rU?dA區(qū)域，兩者共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。本文檔共133頁；當前第98頁；編輯于星期二\3點7分終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，隨著發(fā)夾式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個U）長度的增加，終止效率逐步提高。本文檔共133頁；當前第99頁；編輯于星期二\3點7分3.5.2依賴于ρ因子的終止RNA聚合酶不能識別特異性的轉(zhuǎn)錄終止信號，而加入大腸桿菌ρ因子后該聚合酶就能在DNA模板上準確地終止轉(zhuǎn)錄。ρ因子是一個相對分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它通過催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離。本文檔共133頁；當前第100頁；編輯于星期二\3點7分ATP依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止因子：六聚體蛋白（275kDa），水解NTP沿RNA鏈移動，趕上RNApol并促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。本文檔共133頁；當前第101頁；編輯于星期二\3點7分本文檔共133頁；當前第102頁；編輯于星期二\3點7分RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5’→3’方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3’-OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。本文檔共133頁；當前第103頁；編輯于星期二\3點7分3.6內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾3.6.1RNA中的內(nèi)含子因為真核基因表達往往伴隨著RNA的剪接過程（splicing），從mRNA前體分子中切除被稱為內(nèi)含子（intron）的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子（exon）的編碼區(qū)拼接形成成熟mRNA。本文檔共133頁；當前第104頁；編輯于星期二\3點7分圖用DNA-RNA雜交的方法驗證雞卵清蛋白基因中存在非編碼的內(nèi)含子區(qū)。a.成熟mRNA與帶有該基因的互補鏈DNA序列雜交示意圖；b.雞卵清蛋白的基因結(jié)構(gòu)示意圖。本文檔共133頁；當前第105頁；編輯于星期二\3點7分真核基因大多是斷裂的，也就是說，一個基因可由多個內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。研究表明，內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過99%。本文檔共133頁；當前第106頁；編輯于星期二\3點7分部分人類基因中內(nèi)含子序列所占的比重分析基因長度/bp內(nèi)含子數(shù)量內(nèi)含子占比胰島素1.4267?-球蛋白1.4269血清蛋白181389膠原蛋白組分VII3111771VIII因子1862595萎縮性肌強直因子240078>99本文檔共133頁；當前第107頁；編輯于星期二\3點7分由DNA轉(zhuǎn)錄生成的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——核不均一RNA（hnRNA,heterogeneousnuclearRNA），即mRNA的前體，經(jīng)過5’加“帽”和3’酶切加多聚腺苷酸，再經(jīng)過RNA的剪接，編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分就連接成為一個連續(xù)的可譯框（openreadingframe，ORF），通過核孔進入細胞質(zhì)，作為蛋白質(zhì)合成的模板。本文檔共133頁；當前第108頁；編輯于星期二\3點7分RNA加工過程及其生理功能加工過程推測的生理功能加帽子反應(yīng)mRNA從細胞核向細胞質(zhì)運轉(zhuǎn)，翻譯起始加多聚A反應(yīng)轉(zhuǎn)錄終止，翻譯起始和mRNA降解RNA的剪接從mRNA,tRNA和rRNA分子中切除內(nèi)含子RNA的切割從前體RNA中釋放成熟tRNA和rRNA分子本文檔共133頁；當前第109頁；編輯于星期二\3點7分原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成及其主要加工剪接過程圖示本文檔共133頁；當前第110頁；編輯于星期二\3點7分真核基因平均含有8-10個內(nèi)含子，前體分子一般比成熟mRNA大4-10倍。內(nèi)含子的“功能”及其在生物進化中的地位是一個引人注目的問題。許多人類疾病是內(nèi)含子剪接異常引起的。地中海貧血病人的珠蛋白基因中，大約有1/4的核苷酸突變發(fā)生在內(nèi)含子的5’或3’邊界保守序列上，或者直接干擾了前體mRNA的正常剪接。本文檔共133頁；當前第111頁；編輯于星期二\3點7分表3-9總結(jié)了存在于生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子，其中GU-AG或AU-AC分別代表了不同內(nèi)含子的5’和3’邊界序列。除了邊界序列之外，外顯子與內(nèi)含子交界處的序列，內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列都有可能參與內(nèi)含子的剪接。本文檔共133頁；當前第112頁；編輯于星期二\3點7分表3-9生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子內(nèi)含子類型細胞內(nèi)定位GU-AG細胞核，前體mRNA（真核）AU-AC細胞核，前體mRNA（真核）I類內(nèi)含子細胞核，前體rRNA（真核），細胞器RNA，少數(shù)細菌RNAII類內(nèi)含子細胞器RNA，部分細菌RNAIII類內(nèi)含子細胞器RNA雙內(nèi)含子細胞器RNAtRNA前體中的內(nèi)含子細胞核，tRNA前體（真核）本文檔共133頁；當前第113頁；編輯于星期二\3點7分3.6.2RNA的剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的核內(nèi)mRNA前體分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA和蛋白質(zhì)組成的RNP復(fù)合物（ribonucleo-proteinparticle）。隨著RNA鏈的延伸，每個內(nèi)含子5’和3’兩端的復(fù)合物成對聯(lián)結(jié)，產(chǎn)生60S的顆粒—剪接體(spliceosome)，進行RNA前體分子的剪接。本文檔共133頁；當前第114頁；編輯于星期二\3點7分脊椎動物前體mRNA中常見內(nèi)含子剪接所必需的保守序列5’剪接位位點相鄰的保守序列5’-AG↓GUAAGU-3’3’剪接位位點相鄰的保守序列5’-PyPyPyPyPyPyNCAG↓–3’本文檔共133頁；當前第115頁；編輯于星期二\3點7分由U1snRNA以堿基互補的方式識別mRNA前體5’剪接點，由結(jié)合在3’剪接點上游富嘧啶區(qū)的U2AF（U2auxiliaryfactor）識別3’剪接點并引導(dǎo)U2snRNP與分支點相結(jié)合，形成剪接前體（pre-spliceosome）。剪接前體進一步與U4、U5、U6snRNP三聚體相結(jié)合，形成剪接體。本文檔共133頁；當前第116頁；編輯于星期二\3點7分哺乳動物細胞中mRNA前體上的snRNP是從5’向下游“掃描”，選擇在分支點富嘧啶區(qū)3’下游的第一個AG作為剪接的3’受點。AG前一位核苷酸可以影響剪接效率，一般說來，CAG=UAG>AAG>GAG。如果mRNA前體上同時存在幾個AG，可能發(fā)生剪接競爭。本文檔共133頁；當前第117頁；編輯于星期二\3點7分在高等真核生物個體發(fā)育或細胞分化過程中可以有選擇性地越過某些外顯子或某個剪接點進行變位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱為內(nèi)含子的變位剪接。脊椎動物中大約有5%的基因能以這種方式進行剪接，保證各同源蛋白質(zhì)之間既具有大致相同的結(jié)構(gòu)或功能域，又具有特定的性質(zhì)差異，進而拓展了基因所攜帶的遺傳信息。本文檔共133頁；當前第118頁；編輯于星期二\3點7分與mRNA前體中主要（GU-AG類）和次要（AU-AC類）內(nèi)含子的剪接方式不同的是I、II類內(nèi)含子，因為帶有這些內(nèi)含子的RNA本身具有催化活性，能進行內(nèi)含子的自我剪接。本文檔共133頁；當前第119頁；編輯于星期二\3點7分在I類內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈。再由上游外顯子的自由3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開，上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連。本文檔共133頁；當前第120頁；編輯于星期二\3點7分自由鳥苷酸的3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈。上游外顯子的自由3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開。I類內(nèi)含子的自我剪接過程本文檔共133頁；當前第121頁；編輯于星期二\3點7分在II類內(nèi)含子切除體系中，內(nèi)含子本身的某個腺苷酸2’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈后形成套索狀結(jié)構(gòu)。再由上游外顯子的自由3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被完全切開，上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵相連。本文檔共133頁；當前第122頁；編輯于星期二\3點7分II型內(nèi)含子的剪切機制

內(nèi)含子本身的某個腺苷酸2’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子5’端的磷酸二酯鍵。上游外顯子的3’-OH作為親核基團攻擊內(nèi)含子3’位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使套索結(jié)構(gòu)完全解離。本文檔共133頁；當前第123頁；編輯于星期二\3點7分ThomasR.CechUniversityofColorado

Boulder,CO,USA本文檔共133頁；當前第124頁；編輯于星期二\3點7分ThomasRobertCech(December8,1947inChicago)isaNobelLaureateinchemistry.HegrewupinIowaCity,Iowa.In1966,heenteredGrinnellColle