第三章蛋白質(zhì)研究技術(shù)()

第三章蛋白質(zhì)研究技術(shù)

第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第二節(jié)蛋白質(zhì)的鑒定第三節(jié)蛋白質(zhì)的檢測第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析本文檔共78頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化

一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則二、蛋白質(zhì)分離純化的方法本文檔共78頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分

蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化概圖本文檔共78頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則

1、選擇豐度高、便于提取的材料（磷酸單脂酶,肝、胰、脾豐富，但選幾乎不含磷酸二脂酶的前列腺）2、了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（肝素材料的冷凍和干燥）3、探索有效的抽提和濃縮方法(包括細(xì)胞破碎：機(jī)械、細(xì)胞溶解與自溶；抽提：稀酸減、有機(jī)溶劑、緩沖系統(tǒng)；濃縮：沉淀、吸附、超濾、透析、凍干等)4、建立一套層析組合方法和檢測方法

（如吸附、離子交換、親和層析、凝膠過濾；純化評價(jià)）5、包裝、貯存方法（生產(chǎn)日期、批次、含量、活性或效價(jià)）本文檔共78頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分二、蛋白質(zhì)分離純化的方法粗提：1.鹽析:固體加入法：飽和溶液加入法:2.有機(jī)溶劑沉淀:3.結(jié)晶（10-50mg/ml）

4.等電點(diǎn)沉淀精提：1.離心（centrifugation）2.電泳（electrophoresis）

3.層析（chromatography）注：S1:原飽和度；S2：預(yù)期飽和度；S3：加入液飽和度。V：欲加入體積（ml）；V0：原液體積本文檔共78頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分1.離心（centrifugation）

原理：懸液中的各種粒子（細(xì)胞，細(xì)胞器及大分子）有不同質(zhì)量（mass）或密度（density），故在離心場中有不同沉降速率。

蛋白質(zhì)分子量差別很大，密度差別很?。ú怀^15%）。蛋白質(zhì)的平均密度是1.37g/cm3。結(jié)合蛋白密度差異較大。沉降系數(shù)（sedimentationconstant）：顆粒在單位離心力場中粒子移動(dòng)的速度（S）。本文檔共78頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分離心（centrifugation）

①.差速離心（differentialcentrifugation）②.速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）本文檔共78頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分①.差速離心（differentialcentrifugation）

利用不同物質(zhì)沉降速率的差異，通過離心速度差異分離不同質(zhì)量顆粒的離心技術(shù)。

從組織勻漿中將可溶性的蛋白質(zhì)與不溶性成分分開。離心后，蛋白質(zhì)留在上清液（Supernatant）中，其他成分形成沉淀（Pellet）本文檔共78頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分細(xì)胞成份的差速離心分離離心力

時(shí)間本文檔共78頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分②.速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）

也稱平衡密度梯度離心，根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度差異分離目標(biāo)顆粒的方法。蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；超速離心機(jī)（≈40,000r/min）離心后，分離物分布在相應(yīng)的密度區(qū)帶內(nèi)；本文檔共78頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分

注意：控制時(shí)間：太短，不能充分分離；太長，分離物沉淀到離心管底部。不能精確測定分子量，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的形狀差異影響沉降率；一次分離多種不同類型聚合物或顆粒的最有效方法

多用于分離細(xì)胞器，ＤＮＡ本文檔共78頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分2.電泳（electrophoresis）

帶電顆粒在電場中的移動(dòng)速度的差異,從而將其分離。由電荷–質(zhì)量比決定。電泳分類：按支持物:移動(dòng)界面電泳,聚焦電泳,區(qū)帶電泳（凝膠、線絲）等按電泳裝置:水平平板,垂直平板,圓盤,雙向電泳,毛細(xì)管電泳，脈沖電泳。按電電流（壓）：常壓電泳，高壓電源。本文檔共78頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分①SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）②等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）③雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）④脈沖電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）常用的電泳方法本文檔共78頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分①.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝膠丙烯酰胺（acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；T%=(a:單體g;b:雙體g;m:溶液體積)凝膠孔徑：選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的濃度；C%=(a:b=19:1)凝膠有分子篩效應(yīng)。a+bm100%ba+b100%acrbis本文檔共78頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分SDSSDS（sodiumdodecylsulfate）陰離子洗滌劑，幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵，使亞基解聚(巰基乙醇)，使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)構(gòu)形對遷移率（migrationrate）的影響；SDS以1:2的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷，而且電荷量與蛋白質(zhì)分子量（即肽鏈長度）成正比。所以分子量成為決定蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。本文檔共78頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分SDSSDS分離的蛋白質(zhì)可以用Coomassieblue染色，也可銀染（silverstain）SDS能分離分子量差異小于10%的蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)純化和表觀分子量測定本文檔共78頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分②.等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）凝膠中加入兩性電解質(zhì)（Ampholyte;Ampholime），電泳時(shí)會(huì)形成連續(xù)的pH梯度；聚焦后，各蛋白質(zhì)停留在等電點(diǎn)（pI）相同的位置。IEF能分離pI值僅相差0.01的蛋白質(zhì)（即一個(gè)凈電單位）等電聚焦本文檔共78頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分電泳過程中不連續(xù)電泳的三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)本文檔共78頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分③.雙向電泳（two-dimensional

gelelectrophoresis）分離分子量差異很小的蛋白質(zhì)

雙向電泳=IEF+SDS

第一向：根據(jù)電荷差異用IEF分離第二向：根據(jù)分子量差異用SDS分離本文檔共78頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）IEFSDS本文檔共78頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

蛋白質(zhì)可用染色法（銀染、考馬斯藍(lán)

）或放射自顯影進(jìn)行檢測；斑點(diǎn)挖取做質(zhì)譜鑒定。本文檔共78頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分④.脈沖電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）用于分離大片段DNA（10kb-10Mb）;在電場中，大片段DNA以伸展的方式進(jìn)行移動(dòng);斷電后，DNA分子卷曲成不規(guī)則形狀;DNA從伸展到卷曲所需要的時(shí)間與其長度成正比;電場不斷在兩種方向（有一定夾角,如90°-180°）變動(dòng),如此反復(fù)進(jìn)行,逐步把不同大小的DNA分開.本文檔共78頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分3.層析（chromatography）原理：溶液中蛋白質(zhì)分子與固定相表面結(jié)合及解離的過程中，由于蛋白質(zhì)分子量、帶電性和結(jié)合特異性的不同，而導(dǎo)致結(jié)合與解離的差異，最終使蛋白質(zhì)通過層析柱的流速差異。

固定相的性質(zhì)決定被分離蛋白的分離效率流動(dòng)相固定相本文檔共78頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分層析（chromatography）①.凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography）②.離子交換層析（ion-exchangechromatography）③.親和層析（affinitychromatography）本文檔共78頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分

①.凝膠過濾層析（gelfiltration

chromatography）

分離分子量差異的蛋白質(zhì)；多孔小珠由聚丙烯酰胺（polyacrylamide）、葡聚糖（dextran）或瓊脂糖（agarose）組成；葡聚糖顆粒大分子

小分子本文檔共78頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分凝膠過濾層析小分子進(jìn)入顆粒凝膠內(nèi)部，而大分子被排阻在外，因此小分子在層析柱中流動(dòng)速度慢，從而把混合物按不同分子量分開可根據(jù)洗脫體積（elutionvolume）估計(jì)蛋白質(zhì)分子量，分子量大洗脫體積小。本文檔共78頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分基本原理凝膠上柱后，顆粒外的外水體積（Vo），顆粒內(nèi)體積稱內(nèi)水體積（Vi），顆粒中膠的體積（Vg），因而，總的柱床體積（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi。當(dāng)進(jìn)行洗脫時(shí)，某一溶質(zhì)的洗脫體積（Ve）就取決于Vo，Vi和在兩相中的分配系數(shù)（kd）Ve=Vo+kd·Vi本文檔共78頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分①當(dāng)kd=0時(shí),Ve=Vo，溶質(zhì)全從Vo出來，無分配。②當(dāng)kd=1時(shí),Ve=Vo+Vi,溶質(zhì)全進(jìn)篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但各物質(zhì)不能分開。③當(dāng)0<kd<1時(shí),Ve=Vo+kd·Vi各溶質(zhì)具不同分配，以得到分離。

若已知某一物質(zhì)的kd，據(jù)上式計(jì)算它的洗脫體積（Ve），也可用溶質(zhì)洗脫峰處的洗脫體積來測量。用此法來分離介質(zhì)可用三種模式描述：本文檔共78頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分凝膠類型及型號與蛋白質(zhì)分子量葡聚糖與多孔瓊脂糖珠共價(jià)交聯(lián)（吸水量是型號1/10）瓊脂糖凝膠丙烯葡聚糖凝膠本文檔共78頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分②.離子交換層析（ion-exchange

chromatography,IEC）

離子交換劑為固定相，據(jù)流動(dòng)相中的蛋白離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的親合力差異而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換劑分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子

離子交換劑：離子交換樹脂（Ionexchangeresin）和離子交換纖維素（IonexchangeCellulose),如DEAE-cellulose和CM-cellulose不同的蛋白質(zhì)與交換劑有不同的親和力，而可用不同鹽濃度或pH值的buffer洗脫洗脫示意圖結(jié)合洗脫曲線陽離子陰離子陽離子帶正電荷，與陰離子交換帶負(fù)電荷，與陽離子交換本文檔共78頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分離子交換層析收集陽離子洗脫陰離子本文檔共78頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分陽離子交換劑分離氨基酸本文檔共78頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分③.親和層析（affinitychromatography）親和層析：利用蛋白質(zhì)分子與配體間特異、可逆的親和作用，而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。配體的偶聯(lián)：抑制劑、活化劑、輔酶（輔基）、底物及類似物、抗體、受體等（如外源凝集素、金屬離子等）與固定相偶聯(lián)；上柱結(jié)合：與配體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)被滯留在層析柱中，其他(雜質(zhì))成分流出；洗脫：加入過量的配體、配體類似物或改變洗脫液濃度（或pH）使結(jié)合的蛋白質(zhì)被頂替下來。本文檔共78頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分雜質(zhì)溶液偶聯(lián)親和層析的基本要素本文檔共78頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分親和層析本文檔共78頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分金屬螯合層析法（MCAE）固定相本文檔共78頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分4.膜蛋白的分離方法

膜蛋白：指與生物膜鑲嵌、結(jié)合或附著的一系列蛋白質(zhì)。2004年蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫提交的3D物已超過22,000個(gè)，但幾乎都為可溶性蛋白，膜蛋白不到1%。（Uniprot數(shù)據(jù)庫）膜蛋白是一種難以分離和純化的蛋白質(zhì)。從質(zhì)膜中分離時(shí)，暴露的疏水區(qū)互作，易引起蛋白質(zhì)聚集、沉淀，不易獲得結(jié)晶。去污劑（detergents）是一種兩親分子，能嵌入到磷脂雙層（phospholipidbilayers）中，破壞質(zhì)膜。其疏水部分與烴基結(jié)合，親水部分與水結(jié)合，因此可使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)增溶（Solubilization）.本文檔共78頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分幾種去污劑去污劑包括兩類：非離子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖離子型（ionicdetergents）如脫氧膽酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸納。本文檔共78頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分去污劑的作用機(jī)制：低濃度時(shí)，去污劑以游離形式存在于溶液中。隨著濃度的增加，它們聚集在一起，形成微團(tuán)（micelles）.微團(tuán)親水部分向外，疏水部分向內(nèi)。去污劑開始形成微團(tuán)時(shí)的濃度，為去污劑的特征常數(shù)；稱臨界微團(tuán)濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）。本文檔共78頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分離子型去污劑:除了能與膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合外，還能結(jié)合水溶性蛋白質(zhì)的疏水核心。由于它們帶電，所以能夠破壞蛋白質(zhì)中的鹽鍵和氫鍵,使蛋白質(zhì)變性。非離子型去污劑:比離子型溫和，不同濃度有不同作用方式高濃度（>CMC）時(shí)，與磷脂、膜蛋白一起形成微團(tuán).

低濃度（<CMC）時(shí)，雖然不形成微團(tuán)，但仍能與大部分膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合，起增溶作用.本文檔共78頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分大部分膜周邊蛋白（peripheralprotein）是可溶性。它們借離子鍵或其他弱鍵與特定的膜蛋白結(jié)合，故可用高濃度鹽或能與二價(jià)陽離子（如Ca2+）結(jié)合的試劑進(jìn)行分離。開發(fā)既保持膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)，又高產(chǎn)和高純度純化方法是人們的期待。（NovaGen新開發(fā)TM-PEK:ProteoExtract膜蛋白抽提試劑盒）本文檔共78頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分第二節(jié)蛋白質(zhì)的鑒定

一、分子量測定二、等電點(diǎn)測定三、末端氨基酸殘基測定四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈五、蛋白質(zhì)分子中的脂

本文檔共78頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分一、分子量測定

１.滲透壓（osmoticpressure）２.沉降平衡（sedimentationequilibrium）３.凝膠過濾層析（gelfitrationchromatography）４.SDS５.激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（LDI-TOF-MS）本文檔共78頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分1.滲透壓（osmoticpressure）同時(shí)測定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以π/c對c作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為零,得截距,從而求出M。為避免pH值的影響,在溶解度允許的范圍內(nèi),盡量采用等電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)的緩沖液，并增加溶液中無機(jī)鹽的濃度?？梢詼y分子量在1－10萬范圍的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)裝置簡單，準(zhǔn)確度高。但不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。本文檔共78頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分2.沉降平衡（sedimentationequilibrium）用較低的速度離心（8,000-20,000r/min）離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時(shí)產(chǎn)生擴(kuò)散作用。擴(kuò)散力與離心力作用方向相反，相互平衡。公式：本文檔共78頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分3.凝膠過濾層析（gelfitrationchromatography）公式：logM=K1-K2Ve

Ve：洗脫體積先測出幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve

，以它們的logM對Ve作圖得一直線,再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定蛋白質(zhì)的分子量.樣品可以是不純的。只要它具有專一的生物活性（或標(biāo)準(zhǔn)樣），借助活性找出洗脫峰位置，確定它的洗脫體積就能測定它的分子量.本文檔共78頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分4.SDS公式：logM=K1-K2μR

以幾種標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)分子量的logM對其μR值作圖，根據(jù)待測樣品的μR，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。本文檔共78頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分SDS用以分析蛋白質(zhì)的分子量本文檔共78頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分5.激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（laser

desorptionionization-timeofflight-mass

spectrometry,LDI-TOF-MS）高純度蛋白質(zhì)與有機(jī)酸混合，在靶金屬表面干燥.激光射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后，飛入自由漂移區(qū)，最后到達(dá)檢測器。飛行時(shí)間與分子量成反比，與電量成正比。可測定10-15-2×105MW的蛋白質(zhì)，誤差僅為0.0001。本文檔共78頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分二、等電點(diǎn)測定溶解度法等電聚焦（IEF）

IEF原理IEF測pI本文檔共78頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分三、末端氨基酸殘基測定用于未知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究和基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析N-terminus氨基酸殘基測定C-terminus氨基酸殘基測定本文檔共78頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分

N-terminus氨基酸殘基測定化學(xué)法二硝基氟苯法（Sangerreaction）

（DNFB+肽→DNP-肽）丹磺酰氯法（DNS-Cl）異硫氰酸苯酯法（Edman降解法）（氨基末端→苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物）酶法氨肽酶法（aminopeptidase）氨基酸層析圖譜本文檔共78頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分C-terminus氨基酸殘基測定

化學(xué)法

肼解法（hydrazinolysis）無水肼100℃處理，釋放C端aa

酶法羧肽酶法（carboxypeptidase）選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時(shí)間,得單個(gè)C端aa

本文檔共78頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈血球凝集反應(yīng)（植物凝結(jié)素）糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、R山蘭、schiff試劑）糖組分分析（薄層層析、液相色譜、紅外分析）本文檔共78頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分五、蛋白質(zhì)分子中的脂

蘇丹黑預(yù)染、電泳本文檔共78頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分第三節(jié)蛋白質(zhì)的檢測一、抗體檢測二、WesternBlotting三、放射性同位素標(biāo)記法

本文檔共78頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分一、抗體檢測

多抗（polyclonalantibodies,通常以抗血清的形式存在）是指不同種類抗體的混合物，能識別抗原分子中的多個(gè)抗原決定簇（epitopes）。單抗（monoclonalantibodies）指的是同種抗體，識別抗原分子中的特定抗原決定簇。單抗由一定數(shù)量的相同細(xì)胞產(chǎn)生。這些細(xì)胞來源于同一雜交瘤細(xì)胞（hybridoma：脾:瘤細(xì)胞融合）?？贵w可以檢測表面只相差一個(gè)殘基的蛋白質(zhì)。借助特殊的分析試劑可對蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量或定位（免疫細(xì)胞化學(xué)、染色質(zhì)免疫共沉淀、WesternBlot

）。本文檔共78頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分抗體檢測兩級抗體：一抗和二抗。一抗特異的與抗原結(jié)合，二抗除了與一抗結(jié)合外，還帶有檢測標(biāo)記。檢測標(biāo)記：如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光、顯色基團(tuán)及酶（如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶，催化無色物質(zhì)生成有色物質(zhì)）。ELISA-enzyme-linkedimmunosorbentassay本文檔共78頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分ELISA本文檔共78頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分ELISA結(jié)果本文檔共78頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分二、WesternBlotting靈敏度高，用于檢測極微量的蛋白質(zhì)（Findaneedleinahastack.大海撈針）

與SDS、antibody、enzyme聯(lián)合使用本文檔共78頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分WesternBlotting本文檔共78頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分三、放射性同位素標(biāo)記法

放射性同位素的摻入不影響分子的性質(zhì)。選擇合適的同位素：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头派湫酝凰氐奶卣鳎ㄈ绨胨テ凇⒎派洚a(chǎn)生的能量及能否進(jìn)入細(xì)胞等）進(jìn)行選擇。放射自顯影：用感光材料進(jìn)行感光，如X光膠片，液體乳膠。然后肉眼或顯微鏡觀察，可半定量。定量測定：用計(jì)數(shù)器（counter），如蓋革計(jì)數(shù)器（Geigercounter）、液閃計(jì)數(shù)器（scintillationcounter）。分析生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的定位及運(yùn)動(dòng)。本文檔共78頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定二、已知序列肽鏈的人工合成三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定本文檔共78頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

－Edman降解法（PTH法）

N末端氨基與苯異硫氰酸酯(PITC)在弱堿性條件下,形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)－AA,而從肽鏈上降解,產(chǎn)物可用氣-液色譜法進(jìn)行分離鑒定。

弱堿硝基甲烷苯氨基硫甲酰衍生物本文檔共78頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分HPLC分析氨基酸本文檔共78頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分二、已知序列肽鏈的人工合成合成肽用途：結(jié)構(gòu)分析、抗體制備、活性肽功能、新蛋白研究。

抗體制備：在動(dòng)物體內(nèi)，10-15個(gè)殘基的小肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測及細(xì)胞內(nèi)定位。

新蛋白研究：分析末端AA,反推核苷酸,合成引物,PCR獲得基因或ORF,BLAST分析,同源性比對;蛋白質(zhì)特征及功能分析。本文檔共78頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分tBOC:叔丁氧羰基，保護(hù)氨基酸氨基端.CF3COOH:三氟乙酸，去保護(hù)DCC:二環(huán)己基碳二亞胺，縮合劑HF:氫氟酸，把肽鏈從聚苯乙烯小株上斷裂下來掛接去保護(hù)縮合去保護(hù)斷裂肽鏈人工合成本文檔共78頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\10點(diǎn)25分三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定1.X射線結(jié)晶（X-RayCrystallography）2.冷凍電鏡術(shù)（CryoelectronMicroscopy）3.核磁共振（Nuclearmagneticresonan