米根霉生產(chǎn)平臺(tái)化學(xué)品的代謝工程樣本

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。米根霉生產(chǎn)平臺(tái)化學(xué)品的代謝工程摘要米根霉屬于接合菌的絲狀真菌。它能夠持久的產(chǎn)生平臺(tái)化學(xué)品L-(+)-乳酸,延胡索酸和乙醇。在糖酵解過(guò)程中,所有可發(fā)酵的碳源被代謝為丙酮酸并隨后分布到形成這些產(chǎn)品的途徑中。這些平臺(tái)的形式化學(xué)品的生產(chǎn),在一個(gè)廣泛的碳源范圍內(nèi),是高收率的。L-(+)-乳酸和乙醇的理論產(chǎn)率超過(guò)85％,延胡索酸的在65％以上。參與生產(chǎn)這些化合物代謝途徑的研究和優(yōu)化,需要發(fā)達(dá)的代謝工程技術(shù)和這個(gè)有機(jī)體基因構(gòu)成的知識(shí)。本文著重介紹了當(dāng)前米根霉的代謝工程技術(shù)及其主要發(fā)酵產(chǎn)物代謝途徑的應(yīng)用。關(guān)鍵字米根霉、代謝工程、代謝途徑、轉(zhuǎn)化、外源基因表示介紹估計(jì)在未來(lái)的幾十年里,煤炭,石油和天然氣等化石資源耗盡或不能大量使用。當(dāng)前不斷增加的成本,產(chǎn)油地區(qū)的地緣政治不穩(wěn)定,可持續(xù)發(fā)展問(wèn)題都導(dǎo)致了這個(gè)問(wèn)題。發(fā)展替代能源取代化石資源的原料,這樣就形成了強(qiáng)烈的契機(jī)。已經(jīng)出現(xiàn)地?zé)?、水、風(fēng)、太陽(yáng)能、核能形式的能源發(fā)電。唯一可行的替代運(yùn)輸燃料和平臺(tái)形式的化學(xué)物質(zhì)的生成,是生物質(zhì)產(chǎn)品。借助微生物的發(fā)酵過(guò)程,生物質(zhì)能夠轉(zhuǎn)換成生物質(zhì)燃料和平臺(tái)化學(xué)品。為了能夠與工藝基礎(chǔ)上的石油化工原料競(jìng)爭(zhēng),這些微生物應(yīng)該表現(xiàn)出較高的產(chǎn)品產(chǎn)量(克每克),生產(chǎn)力(克每升每小時(shí)),和產(chǎn)品的效價(jià)(克每升)。其它的先決條件是能夠使用許多碳源,抵抗生物質(zhì)預(yù)處理釋放的發(fā)酵抑制劑,能夠在沒(méi)有復(fù)雜的生長(zhǎng)因子中生長(zhǎng)等。米根霉是一種能夠在高含量的生物質(zhì)衍生糖中生產(chǎn)乙醇,L-(+)-乳酸,延胡索酸的真菌。這些發(fā)酵產(chǎn)物的市場(chǎng)大,表明了這種微生物生產(chǎn)平臺(tái)化學(xué)潛能。在,全球生產(chǎn)的乙醇為17.25十億公升,而且到增加的量超過(guò)740億升。到2020年,這個(gè)市場(chǎng)預(yù)計(jì)將增加超過(guò)1250億升。全球市場(chǎng)的L-(+)-乳酸在超過(guò)100,000噸,,預(yù)計(jì)將增加259000噸。L-(+)-乳酸,當(dāng)前主要用作食品或飼料酸化劑,但它也能夠被用于在快速市場(chǎng)中的的可再生塑料,溶劑,或含氧化合物和動(dòng)物飼料。延胡索酸的市場(chǎng)規(guī)模較小,但估計(jì)量仍有90,000噸。這個(gè)市場(chǎng)也有望在未來(lái)幾年內(nèi)增加。延胡索酸當(dāng)前在食品工業(yè)中直接作為pH調(diào)節(jié)劑,防腐劑,增香劑使用。由于它的結(jié)構(gòu),它可作聚酯和醇酸樹(shù)脂的產(chǎn)物離子。除了這些平臺(tái)化學(xué)品,米根霉也可用于各種各樣商業(yè)有關(guān)酶的生產(chǎn)。Ghosh和Ray最近都在生物技術(shù)工藝中應(yīng)用米根霉。代謝工程技的使用,使米根霉產(chǎn)物的形成得到優(yōu)化,經(jīng)過(guò)同源基因過(guò)度表示,或淘汰現(xiàn)有相互競(jìng)爭(zhēng)的途徑,使異源基因引入化學(xué)品的生產(chǎn)。本文綜述了國(guó)家當(dāng)前最先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)用于米根霉通路工程以及如何用它們來(lái)研究和提高其主發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量。米根霉有機(jī)體米根霉是絲狀真菌,是接合菌綱的毛霉菌目。根霉屬的黑根霉的描述在1820年首次建立,以形成發(fā)酵產(chǎn)物而聞名,如乙醇,L-(+)-乳酸,延胡索酸,以及在一定程度的L-(+)-蘋(píng)果酸。曲霉菌,鐮刀菌,和青霉是有生產(chǎn)延胡索酸的能力。米根霉在亞洲常見(jiàn)于食品發(fā)酵,生產(chǎn)酒精飲料,鴨腳稗,或豆豉,一般視為安全菌株。盡管如此,米根霉也可能成為人類(lèi)病原體,毛霉真菌病感染后具有較高的患病率。大多數(shù)毛霉菌感染病例有潛在的疾病,如血清鐵水平升高,外傷,或免疫系統(tǒng)削弱。米根霉是在自然界普遍存在,而且發(fā)現(xiàn)也存在在腐爛的有機(jī)材料上。它能夠在各種各樣的碳源上生長(zhǎng),例如,甘油,乙醇,乳酸,葡萄糖,甘露糖,果糖,蔗糖,木糖,纖維二糖,脂肪酸,和油。所有提及的糖都證明是L-(+)-乳酸或延胡索酸生產(chǎn)離子的一種底物。另外,米根霉具有分解淀粉,木聚糖,果膠,纖維素的能力,能夠轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)殘留物中的聚合物。它能夠在很寬的溫度范圍內(nèi)(不超過(guò)40℃)和pH值范圍內(nèi)(從4至9)生長(zhǎng)良好,這表明了它的強(qiáng)大性能和廣泛適應(yīng)潛力。米根霉生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)第一個(gè)提及米根霉有產(chǎn)生有機(jī)酸的能力是在Saito19用華根霉生產(chǎn)乳酸和Ehlich用黑曲霉主要生產(chǎn)延胡索酸及乳酸,琥珀酸,和蘋(píng)果酸的報(bào)道中。Takahashi和她的同事的研究表明,還有其它的產(chǎn)品形成,如乙醇。Ward等人,利用米根霉在葡萄糖中生產(chǎn)L-(+)-乳酸,最終產(chǎn)率為0.62克/克。從那時(shí)起,米根霉已被廣泛的用于生產(chǎn)有機(jī)酸,乙醇,酶,和其它市售產(chǎn)品。最近Ghosh和Ray做了這些研究。正如前面提到的,米根霉能夠高效地生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物。有氧呼吸L-(+)-乳酸生產(chǎn)的最大理論產(chǎn)率是2摩爾的L-(+)-乳酸每摩爾的D-葡萄糖的消耗,即1.0克L-(+)-乳酸每克D-葡萄糖。延胡索酸的最大理論產(chǎn)率是2摩爾延胡索酸每摩爾的D-葡萄糖的消耗,即1.3克延胡索酸每克D-葡萄糖。L-(+)-乳酸的最高產(chǎn)量為0.88克/克,延胡索酸的最高產(chǎn)量是0.86克/克,主要副產(chǎn)物為乙醇。這些還表明米根霉能夠抵抗高濃度產(chǎn)物和超過(guò)100克/升D-葡萄糖的濃度的能力。理論產(chǎn)率是2摩爾的乙醇每摩爾D-葡萄糖的消耗(0.51克/克D-葡萄糖)。當(dāng)米根霉生長(zhǎng)在D-葡萄糖中時(shí),得到產(chǎn)率接近這個(gè)最大收率。表1列出了米根霉生產(chǎn)乙醇的一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。當(dāng)前利用D-葡萄糖用于乙醇生產(chǎn)的微生物是釀酒酵母。用于乙醇生產(chǎn)的野生型釀酒酵母的主要缺點(diǎn)是不能利用半纖維素水解物中的戊糖。米根霉能夠在許多碳源上生長(zhǎng),如5碳糖,而且生長(zhǎng)要求低。另外,它是能夠耐受存在于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酸水解物中的抑制劑,并有直接利用纖維素和半纖維素進(jìn)行緩慢生長(zhǎng)的能力。米根霉的遺傳多樣性在D-葡萄糖上生長(zhǎng)時(shí),米根霉可根據(jù)主要產(chǎn)生的有機(jī)酸分為兩種類(lèi)型。其中一組主要產(chǎn)生L-(+)-乳酸,而另一組是主要的發(fā)酵產(chǎn)物是延胡索酸和L-(+)-蘋(píng)果酸。對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)的編碼基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,獲得一些信息。測(cè)定米根霉NRRL395有兩種NAD-依賴(lài)同工酶(LDHA和LDHB)。在生長(zhǎng)過(guò)程中有可發(fā)酵碳源如D-葡萄糖,D-木糖,海藻糖的存在的時(shí)候LDHA編碼基因被表示。與此相反,有不可發(fā)酵碳源如乙醇,甘油,乳酸的時(shí)候LDHB編碼基因的表示。Saito等人發(fā)現(xiàn)了L-(+)-乳酸生產(chǎn)與編碼基因之間的關(guān)系。產(chǎn)L-(+)-乳酸菌株含有LDHA和LDHB時(shí)候被分為I型菌株。延胡索酸和L-(+)-蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌株只含有LDHB被分為II型菌株。從兩種不同類(lèi)型的各種基因和標(biāo)記序列分析后,確定它們的系統(tǒng)發(fā)育不同。在這些結(jié)果的基礎(chǔ),提出了對(duì)產(chǎn)延胡索酸和L-(+)-蘋(píng)果酸為主的菌株重新分類(lèi),如代氏根霉。這是第一個(gè)屬于II型菌株根霉的名字。擬議重新分類(lèi)的II型菌株代氏根霉不是廣泛應(yīng)用。因此,代氏霉菌仍被稱(chēng)為米根霉?；蚪M分析,米根霉99-880(II型株)的基因組出版了。這對(duì)這一領(lǐng)域的研究做出了巨大的貢獻(xiàn),對(duì)分子技術(shù)有了新的看法。該菌株是第一個(gè)被作為接合菌世系測(cè)序的有機(jī)體。它在Ma等人分析出的基因復(fù)制中十分重要。99-880米根霉的基因組是45.3Mbp大小,包括20％的轉(zhuǎn)座子。總共對(duì)13,895個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),沒(méi)有轉(zhuǎn)座子重疊。對(duì)重復(fù)基因?qū)退齻児餐倪M(jìn)化序列分析后,得出的結(jié)論是發(fā)生共同祖先的全基因組復(fù)制事件。與新基因復(fù)制結(jié)合導(dǎo)致兩到十倍增加基因家族相關(guān)的病原體毒力,特殊真菌細(xì)胞壁合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。全基因組復(fù)制允許在多元化的不利條件下生長(zhǎng)。這可能包括宿主的免疫防御反應(yīng),并能解釋在感染毛霉菌病中米根霉菌的高患病率。由于全基因組的重復(fù),通路經(jīng)過(guò)基因敲除或沉默策略進(jìn)行修改遇到相當(dāng)大的困難。屬于毛霉目的真菌的轉(zhuǎn)化當(dāng)前有幾種毛霉目生物體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研制,包括的灰綠犁頭霉,卷枝毛霉,米黑毛霉,布拉克須霉,雪白根霉和微小根毛霉。在一般情況下,毛霉目異源基因表示的關(guān)鍵是DNA重組導(dǎo)入和復(fù)制機(jī)制的影響。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化引入的DNA將保持額外染色體和自主復(fù)制,因?yàn)樗灰筇囟ǖ膹?fù)制起點(diǎn)。因此,轉(zhuǎn)化一般表現(xiàn)出分裂不穩(wěn)定型。這些質(zhì)粒的中除了自主復(fù)制,還將形成高分子量的級(jí)聯(lián)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)將基因組DNA遷移,從而導(dǎo)致整合的不正確。為了增加在米根霉整合的可能性,同源區(qū)域的質(zhì)粒在改造中引入雙鏈斷裂(DSB)。這使發(fā)生整合增加到20%,剩下的仍含有質(zhì)粒連接。據(jù)推測(cè),級(jí)聯(lián)質(zhì)粒是整合到基因組中的重新連接之前的結(jié)果。這種能夠重新連接的修復(fù)機(jī)制被稱(chēng)為非同源末端連(NHEJ)。發(fā)生NHEJ時(shí),只有少數(shù)幾個(gè)的同源堿基對(duì)空閑。當(dāng)兩端的同源性越大,占主導(dǎo)地位的修復(fù)方法是單鏈退火(SSA)。對(duì)DNA修復(fù)的深入研究,我們采取帕爾多等人的研究。選擇針對(duì)已經(jīng)在載體選擇標(biāo)記區(qū)進(jìn)行移碼突變的NHEJ,與一個(gè)已經(jīng)在基因組的選擇標(biāo)記區(qū)發(fā)生突變的受體菌株結(jié)合。生長(zhǎng)只有當(dāng)質(zhì)粒由一個(gè)單一的同源交叉到基因組中整合時(shí)才恢復(fù),這會(huì)導(dǎo)致一個(gè)功能的選擇標(biāo)記和一個(gè)包含突變的拷貝。改造后這個(gè)載體,轉(zhuǎn)化測(cè)試顯示只有8％的是原養(yǎng)型。轉(zhuǎn)化體的其余部分仍含有級(jí)聯(lián)質(zhì)粒。當(dāng)對(duì)所涉及的基因序列進(jìn)行了分析時(shí),它是載體上的非功能性拷貝的修復(fù),而不是基因組拷貝。據(jù)推測(cè),這是由于非交叉機(jī)制如打破誘導(dǎo)復(fù)制或依賴(lài)合成鏈退火。另一項(xiàng)研究可,能是在NHEJ中加強(qiáng)雙鏈斷裂修復(fù)對(duì)DNA斷裂的影響。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,載體酶切成一個(gè)個(gè)含有單一位點(diǎn)的懸浮物添加到無(wú)細(xì)胞提取物中,溫育30分鐘后,觀察載體的二聚物,三聚物和降解產(chǎn)物。溫育到1.5小時(shí)延伸,會(huì)使二聚體和三聚體的減少了及高分子量的結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)?；谳d體中包含的5'或3'突出對(duì)孢子進(jìn)行改造,在恢復(fù)原養(yǎng)型生長(zhǎng),觀察到無(wú)明顯差異。在同一研究中,一個(gè)載體,選擇整合到基因組中。此載體含有一個(gè)被截?cái)嗟膒yrG選擇標(biāo)記物,含有該5'端一半的基因。受體菌株已經(jīng)包含在選擇標(biāo)記的基因組復(fù)制3'端一半處的一個(gè)點(diǎn)突變?？尚械霓D(zhuǎn)化只能夠經(jīng)過(guò)基因組發(fā)生整合的方式獲得。所有的轉(zhuǎn)化體生成于選擇標(biāo)記的截?cái)?進(jìn)行載體整合和經(jīng)常出現(xiàn)多拷貝插入的測(cè)試。截?cái)噍d體轉(zhuǎn)化效率與非截?cái)噍d體的相比低20倍,這很可能是選擇單一整合引起的。米根霉的代謝工程技術(shù)有幾種方法已被應(yīng)用于改變米根霉的基因組及其轉(zhuǎn)錄中。這些方法基于引入外源DNA或隨機(jī)突變。米根霉的隨機(jī)誘變隨機(jī)突變對(duì)破壞基因的功能或提高生產(chǎn)力的代謝過(guò)程是一種強(qiáng)有力的方式。在米根霉中能夠經(jīng)過(guò)化學(xué)誘變來(lái)完成。例如利用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體,或用硫酸二乙酯增加L-(+)-乳酸的產(chǎn)量。隨機(jī)誘變能夠經(jīng)過(guò)紫外輻射,鈷-60的γ射線,或由低能離子注入產(chǎn)生。這種技術(shù)的缺點(diǎn)是會(huì)形成多個(gè)基因突變。同時(shí)需要花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間用于檢查和篩選。要用有效的篩選方法篩選出所需的突變體,如利用黃等人創(chuàng)造的篩選方法篩選高產(chǎn)酸突變體。本研究使用紫外輻射誘變米根霉孢子,并根據(jù)酸化的瓊脂平板上PH指示劑顏色的變化進(jìn)行篩選。異源DNA轉(zhuǎn)化除了前面所述的隨機(jī)誘變,另一種改變基因組的方法是異源DNA的導(dǎo)入,近年來(lái)有關(guān)米根霉的(異源性)基因表示的研究進(jìn)展很快,,而且描述了三個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中一個(gè)系統(tǒng)是基于微生物根癌農(nóng)桿菌DNA轉(zhuǎn)移。農(nóng)桿菌能夠?qū)⑵銬NA的一部分即轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)轉(zhuǎn)移到了受體中去,對(duì)于異源表示來(lái)說(shuō),T-DNA是改變的目的基因。重組后,T-DNA整合到染色體上。Michielse等人證明了基因重組的原理。米根霉有一種乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶的pyrG基因突變體,這是由于T-DNA插入引起的。使用原生質(zhì)體作為起始原料,可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體,但不能是孢子或萌芽孢子。總之,所有的有絲分裂在非選擇性條件下穩(wěn)定時(shí),分離出8個(gè)轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)化子發(fā)生基因重組。這種重組不引入額外的DNA,不能恢復(fù)pyrG基因組的的復(fù)制功能。余下的6個(gè)轉(zhuǎn)化子,基因組中pyrG復(fù)制整合。有趣的是,在6個(gè)轉(zhuǎn)化子的DNA引入整合軌跡表示整合在同一點(diǎn)。在基因組中檢測(cè)到?jīng)]有DNA載體連接的T-DNA或另外連接的基因。這個(gè)系統(tǒng)中目的基因不表示,因此,雖然基因重組了,但異源基因不表示。這可能是合成的毒力蛋白因子包裹DNA并阻止重組發(fā)生。描述DNA轉(zhuǎn)移的另一種方法出現(xiàn)在土壤桿菌的系統(tǒng)研究中,.在這種方法中,從菌絲體中產(chǎn)生原生質(zhì)體,并經(jīng)過(guò)CaCl2/PEG的方法進(jìn)行DNA載體的轉(zhuǎn)化。本研究采用直線形或圓形的DNA載體以增加重組的概率。在農(nóng)桿菌系統(tǒng)相比,其產(chǎn)生的表型不穩(wěn)定,而且DNA載體依然保持獨(dú)立和能自主復(fù)制。第三個(gè)介紹DNA的系統(tǒng)是粒子轟擊DNA傳遞系統(tǒng)。粒子轟擊系統(tǒng)首次用來(lái)介紹植物細(xì)胞中的DNA。它是當(dāng)前國(guó)內(nèi)在米根霉中唯一成功用于異源基因表示的系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中,使用包被有鎢粒子的DNA載體轉(zhuǎn)化孢子。對(duì)于米根霉,它首先被用來(lái)判斷NRRL395米根霉的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中導(dǎo)入的DNA的命運(yùn)。尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型經(jīng)過(guò)引入同一菌株的pyrG拷貝功能的載體來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充。多年來(lái),這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)一步完善來(lái)表示同源基因如LDHA。其次是綠色熒光蛋白(GFP)的表示作為異源基因表示的證明。,來(lái)源于米根霉99-880II型菌株的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型與I型菌株ldhA基因發(fā)生轉(zhuǎn)化。在這株功能實(shí)現(xiàn)異源基因表示與藻青素合成酶編碼基因(CPHA)從藍(lán)藻的目標(biāo)產(chǎn)生藍(lán)藻米根霉。在這個(gè)菌株中,功能性異源基因經(jīng)過(guò)與源于藍(lán)藻的合成酶編碼基因(CPHA)結(jié)合進(jìn)行表示,達(dá)到從米根霉中生產(chǎn)藻青素的目標(biāo)。藻青素具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),可作綠色化學(xué)品的產(chǎn)品。另外,米根霉中表示了黑曲霉的木聚糖酶編碼基因(木聚糖酶)。從GFP得到的載體的表示包含源于磷酸激酶1(PGK1),丙酮酸脫羧酶(PDCA),糖化酶(amyA)的三個(gè)不同的啟動(dòng)子元件。在這些啟動(dòng)子元素中,PDCA啟動(dòng)子給了最強(qiáng)的信號(hào),并被選定為所有表示啟動(dòng)子元素的現(xiàn)代構(gòu)造描述。分析GFP表示轉(zhuǎn)化體是,發(fā)現(xiàn)當(dāng)熒光信號(hào)是存在于一個(gè)連字符,它沒(méi)有集中在一個(gè)特定的細(xì)胞器或菌絲頂端,而是均勻地分布。這些轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄分析后,得出的結(jié)論是,轉(zhuǎn)錄水平和GFP的堆積有明確的相關(guān)性。有趣的是,該基因的拷貝數(shù)沒(méi)有顯著影響蛋白的積累?；蛱蕹?jīng)過(guò)導(dǎo)入基因生產(chǎn)新的酶,接著DNA也被引進(jìn)來(lái)建立基因淘汰。隨著雙交換事件,基因被淘汰,因此,能夠研究代謝途徑中基因功能或效果的特定損失。當(dāng)前,米根霉中詳細(xì)描述雙交叉事件成功的的唯一的例子是高親和力鐵通透酶編碼基因(FTR1)。此基因宿主感染過(guò)程中在米根霉中強(qiáng)烈表示,體現(xiàn)了FTR1在米根霉的致病性中的作用。為了研究FTR1的作用,來(lái)自99-880米根霉的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體成功形成了雙交換同源重組的基因敲除。在所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中,FTR1編碼基因在非選擇性條件下未檢測(cè)到。然而,選擇壓力下,推定的FTR1無(wú)效突變體的表型效應(yīng)丟失,再次檢測(cè)到FTR1編碼基因。選擇性條件下,米根霉的多核性質(zhì)勝過(guò)了ftr1無(wú)效突變體的表現(xiàn)型。經(jīng)過(guò)連續(xù)14個(gè)以上的孢子形成和在非選擇性條件下單菌落接種,經(jīng)過(guò)PCR分析未檢測(cè)到該基因。然而,在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)內(nèi),該基因被再次經(jīng)過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。據(jù)推測(cè),ftr1編碼基因可能必須存在于貧鐵培養(yǎng)基中,因此,不可能得到其無(wú)效突變體。另外,在本文中,在這個(gè)菌株中有可能獲得咪唑甘油磷酸脫氫酶(HIS3)無(wú)效突變體,雖然這些數(shù)據(jù)沒(méi)有公布。RNA干擾另一種降低基因表示的優(yōu)良方法是RNA干擾(RNAi)。RNA干擾是一種新近發(fā)現(xiàn)的雙鏈RNA觸發(fā)核糖核酸(mRNA)信使的同源序列降解的機(jī)制。其結(jié)果是,減少或取消相應(yīng)的蛋白質(zhì)的翻譯。RNA干擾機(jī)制,幾種蛋白質(zhì)是必須的:一個(gè)dicer酶,Argonaut蛋白,以及依賴(lài)RNA的RNA聚合酶(RdRP的)。內(nèi)切酶把雙鏈RNA切割成雙鏈的短干擾RNA(RNA干擾)。argonaut蛋白隨后與干擾RNA片段結(jié)合,并保留單鏈RNA。argonaut蛋白復(fù)合物識(shí)別mRNA的同源序列,從而使mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì).RdRP識(shí)別切割的mRNA鏈,這將產(chǎn)生更多的siRNA,從而引起嚴(yán)重的回應(yīng)。對(duì)于真菌,經(jīng)過(guò)發(fā)夾RNA形成高效穩(wěn)定的RNA干擾。另外,合成的siRNA相繼出現(xiàn)會(huì)引發(fā)的RNAi的回應(yīng)。有人預(yù)測(cè),基于99-880米曲霉菌株的基因組序列,含有兩個(gè)Argonaut蛋白拷貝,一個(gè)dicer酶,和五個(gè)RdRP的編碼基因。在同一研究中,研究高親和力鐵通透編碼基因(FTR1)的作用,并利用RNA干擾沉默基因及研究其作用。ftr1基因經(jīng)過(guò)間隔元件保持分開(kāi)的正義和反義(450個(gè)基點(diǎn))產(chǎn)生的一個(gè)結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄后的構(gòu)建,啟動(dòng)RNAi的過(guò)程形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hpRNA)。沉默基因用該方法取得成功,并用此構(gòu)造產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的鐵的吸收減少了大約50％。另外,對(duì)小鼠的致病性大大降低。將轉(zhuǎn)化體用于感染小鼠,并重新從死于感染的小鼠和健康小鼠中分離出來(lái)。發(fā)現(xiàn)感染的死小鼠中的轉(zhuǎn)化體已經(jīng)失去了RNAi載體,但在健康人群中,載體依然存在。類(lèi)似于hpRNA干擾,siRNAs的成功的用于LDHA基因和LDHB基因的沉默。這些基因的沉默,以減少了丙酮酸流向L-(+)-乳酸,從而提高了乙醇形成。因此,在LDHA編碼基因區(qū)域中設(shè)計(jì)了合成siRNA,它與LDHB基因有高度的序列相似性。siRNAs有25個(gè)核苷酸長(zhǎng),用于改造米根霉CCUG28958產(chǎn)生的原生質(zhì)體?？偣哺綦x出6個(gè)組合式轉(zhuǎn)化體并在含有30g/L的D-葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。組合式轉(zhuǎn)化體的平均L-(+)-乳酸產(chǎn)量為0.01克/克D-葡萄糖,這表示與親本株0.07克/克的產(chǎn)率相比減少了86％。乙醇產(chǎn)量從0.39至0.45克/克平均增加15％。組合之后,甘油,琥珀酸鹽,和丙酮酸鹽的產(chǎn)率增加而生物量生產(chǎn)減少。siRNA基因沉默的效果是短暫的,因此不適合用于工業(yè)過(guò)程。這兩項(xiàng)研究的結(jié)果表明,RNAi能夠有效地用于基因表示的下調(diào)。最后,它是能夠經(jīng)過(guò)隨機(jī)誘變和轉(zhuǎn)基因改變米根霉菌株的基因組。異源基因表示的關(guān)鍵是難以獲得基因組整合的DNA載體。另外,有多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記條件的缺乏和顯性選擇標(biāo)記。因此,需要進(jìn)一步的研究米根霉的利用的潛力,來(lái)進(jìn)行平臺(tái)化學(xué)品的生產(chǎn)。主發(fā)酵產(chǎn)品的途徑米根霉中主要發(fā)酵產(chǎn)物途徑由丙酮酸彼此連接。在米根霉,所有發(fā)酵的碳源都代謝成丙酮酸。丙酮酸隨后進(jìn)入一些途徑,如負(fù)責(zé)發(fā)酵終產(chǎn)物的形成途徑。這個(gè)結(jié)點(diǎn)被命名為丙酮酸的分支點(diǎn)。培養(yǎng)基中溶解氧影響丙酮酸分支點(diǎn)的流向。(微)厭氧條件下,碳源反應(yīng)生成的乙醇,而在有氧條件下,過(guò)量的碳源時(shí),流向有機(jī)酸的形成。這種現(xiàn)象在使用含70g/L的D-葡萄糖的旋轉(zhuǎn)纖維床反應(yīng)器的研究中清楚得到證實(shí)。最高的乙醇產(chǎn)率(理論產(chǎn)率的37％)是在20％的溶解氧(DO)的條件下得到的。后增加至25％和50％,乙醇理論產(chǎn)率下降到26％和15％。這些結(jié)果也演示了含有70g/L的D-葡萄糖攪拌釜式生物反應(yīng)器的使用。在低的轉(zhuǎn)速條件下乙醇的最高產(chǎn)率超過(guò)理論產(chǎn)率的50％。攪拌或增加曝氣量后的產(chǎn)量還會(huì)下降。乙醇發(fā)酵途徑允許在缺氧的情況下,短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)。有機(jī)酸的生產(chǎn)認(rèn)為是高糖濃度的溢出機(jī)制的結(jié)果,因?yàn)榧?xì)胞到環(huán)境樣本中不會(huì)遇到這些高濃度。乙醇生成途徑在丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醇脫氫酶(ADH)的聯(lián)合作用下,催化丙酮酸生成乙醇。NRRL395米根霉,檢測(cè)到兩個(gè)PDC-編碼基因,在非發(fā)酵碳源甘油的存在下這是不表示的,但加入D-葡萄糖后,很容易表示。另外,缺氧條件下增加了這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。在厭氧和好氧條件下比較PDC的活性,在厭氧條件下,酶的活性強(qiáng)大約3倍。雖然在PDC活性和編碼基因得到一些認(rèn)識(shí),可是ADH酶的性子和編碼基因也做些工作。與NRRL395米根霉在厭氧條件下生長(zhǎng)相比,有氧條件下ADH活性高約7倍。另外,II型菌株似乎比I型株產(chǎn)生更多的乙醇。這可能是L-(+)-乳酸形成途徑缺陷的原因。在發(fā)酵過(guò)程中,碳源被代謝為丙酮酸。丙酮酸庫(kù)分布在許多途徑中。能夠假設(shè)當(dāng)一個(gè)途徑是不存在的,可對(duì)剩余的途徑提供更多丙酮酸,因此在富含碳的環(huán)境中增加乙醇量的形成。L-(+)-乳酸途徑在有氧條件下,發(fā)酵的主要產(chǎn)物是有機(jī)酸,可能由于PDC和ADH的基因的表示的下調(diào)。L-(+)-乳酸是一個(gè)單一酶步驟產(chǎn)生的,由NAD+-依賴(lài)型L乳酸脫氫酶催化丙酮酸產(chǎn)生的。在基因槍法轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的幫助下,可能進(jìn)一步的了解產(chǎn)生l-(+)-乳酸背后的分子機(jī)制。在II型菌株99-880米根霉衍生的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體中引入I型菌株NRRL395米根霉的LDHA編碼基因。生成的轉(zhuǎn)化體將25％以上的初始D-葡萄糖轉(zhuǎn)換L-(+)-乳酸的,而受體菌株不產(chǎn)生任何L-(+)-乳酸。L--(+)-乳酸生產(chǎn)的這種增加被耦合到延胡索酸和乙醇生物量形成的減少,從而使丙酮酸流定向從丙酮酸分支點(diǎn)的其它產(chǎn)品走向L-(+)-乳酸。為了進(jìn)一步研究L-(+)-乳酸形成的分子機(jī)制,供體和受體菌株的LDHB編碼基因在大腸桿菌中表示。酶解分析,兩個(gè)純化LDHB蛋白質(zhì)的演示發(fā)現(xiàn)NADH是利用丙酮酸生成L-(+)-乳酸的輔酶。然而,未轉(zhuǎn)化的II型菌株不能產(chǎn)生任何L-(+)-乳酸。據(jù)推測(cè),不能進(jìn)行L-(+)-乳酸生產(chǎn)是嚴(yán)緊的轉(zhuǎn)錄調(diào)控所造成。Northern印跡分析,沒(méi)有檢測(cè)到LDHB轉(zhuǎn)錄,更敏感的RT-PCR方法才能檢測(cè)到基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄量非常低可能是導(dǎo)致為什么一些II型菌株能夠產(chǎn)生少量的L-(+)-乳酸的原因。延胡索酸和l-(+)-蘋(píng)果酸的產(chǎn)生途徑從丙酮酸分支點(diǎn)起始的其它發(fā)酵產(chǎn)物是延胡索酸和1-(+)-蘋(píng)果酸。這些有機(jī)酸生產(chǎn)主要經(jīng)過(guò)位于細(xì)胞質(zhì)中的還原性三羧酸(TCA)循環(huán)。這一途徑的第一個(gè)酶是分布在細(xì)胞質(zhì)中的丙酮酸羧化酶(PYC)。在真核生物中,這種酶是一般只出現(xiàn)在線粒體中。PYC是生物素依賴(lài)酶并將丙酮酸羧化成草酰乙酸。為了充分將丙酮酸轉(zhuǎn)換升-(+)-蘋(píng)果酸和延胡索酸,位于細(xì)胞質(zhì)中的其它兩個(gè)酶也是必須的。蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)將草酰乙酸轉(zhuǎn)換成L-(+)-蘋(píng)果酸,并在延胡索酸酶(FUM)的作用下水合(可逆)成延胡索酸。延胡索酸隨后運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜。研究米根霉中延胡索酸的生產(chǎn)中所涉及的酶,最好是FUM酶。據(jù)弗里德伯格等在Northern雜交和引物延伸分析的基礎(chǔ)上推測(cè),米根霉有一個(gè)基因編碼FUM酶。然而,位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是不同的。酶動(dòng)的反應(yīng)力學(xué)的不同可能是由于區(qū)室的不同條件或翻譯后的修飾。這在真核生物中是常見(jiàn)的,如大鼠中胞漿和線粒體酶來(lái)源于同一基因。然而,Goldberg等人建認(rèn)為,在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中有兩個(gè)基因編碼FUM酶。為了確定哪個(gè)假設(shè)是正確,克隆了NRRL1526米根霉DNA基因組中延胡索酸酶基因,它產(chǎn)生一個(gè)單一的轉(zhuǎn)錄物。產(chǎn)生的抗血清防止釀酒酵母中FUM酶部分中和米根霉的無(wú)細(xì)胞提取物中酶的活性。為了確定是否不同延胡索酸酶是出現(xiàn)在不同的生長(zhǎng)階段,測(cè)定生長(zhǎng)階段和產(chǎn)酸階段的菌絲體的無(wú)細(xì)胞提取物中酶的活性。生長(zhǎng)階段菌絲FUM的Km為0.78毫摩爾的延胡索酸,2.9毫摩爾L的L-(+)-蘋(píng)果酸。延胡索酸的存在不抑制延胡索酸酶的活性。然而2毫摩爾L-1的延胡索酸的存在完全阻斷產(chǎn)酸菌絲體中的FUM酶活性。作者表示,這可能是在產(chǎn)酸條件誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特FUM酶。這種酶將產(chǎn)生延胡索酸,而且逆反應(yīng)完全阻斷延胡索酸量的增加。作者曾試圖獲得這種獨(dú)特的FUM酶,它的半衰期是2小時(shí)。由弗里德伯格等克隆的基因沒(méi)有進(jìn)一步的特征。當(dāng)在新鮮的培養(yǎng)基中接種生長(zhǎng)前期生物時(shí),觀察到延胡索酸生產(chǎn)在酸性條件中延遲,表明存在兩個(gè)不同的基因。為了進(jìn)一步闡明延胡索酸酶的假說(shuō),Song等人克隆了ATCC20344米根霉的FUM酶的編碼基因序列?；蛟诖竽c桿菌中表示并分析相應(yīng)酶。得出的結(jié)論是FUM-編碼基因負(fù)責(zé)生產(chǎn)延胡索酸。L-(+)-蘋(píng)果酸的Km為0.46毫米,當(dāng)延胡索酸濃度超過(guò)2毫米時(shí)阻止延胡索酸反應(yīng)生成L-(+)-蘋(píng)果酸。這些與Battat,Pines,andGoldb