第四章愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織概念：組織培養(yǎng)中，利用特定的條件，促使原已分化并具有一定功能的植物細(xì)胞脫離原來的發(fā)展軌道，失去原有的狀態(tài)和功能而成為能進(jìn)行活躍分裂的一團(tuán)細(xì)胞，稱為愈傷組織。愈傷組織的相關(guān)概念愈傷組織培養(yǎng)：將母體植株上的各個(gè)部分切下作為外值體，接種到無菌的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和發(fā)育的一門技術(shù)。本文檔共39頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)郁李的愈傷組織本文檔共39頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分再分化：愈傷組織在一定的培養(yǎng)條件下又可以經(jīng)過胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，或經(jīng)過器官發(fā)生形成單極性的芽或根，進(jìn)而重新形成完整的植株，這后一段過程一般稱為再分化。

脫分化：一個(gè)已停止分裂的成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。細(xì)胞的全能性的體現(xiàn)本文檔共39頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分一、愈傷組織形成的條件外植體（explant)培養(yǎng)條件(conditionofculture)誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。本文檔共39頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分1、外植體的選擇一般情況下：雙子葉植物比單子葉和裸子植物容易幼年細(xì)胞和組織比成年的容易二倍體細(xì)胞比單倍體細(xì)胞容易同一種植物不同基因型誘導(dǎo)愈傷組織的能力也不相同（24個(gè)水稻抗稻瘟病單基因鑒別品系懸浮細(xì)胞系的建立，14.3%~97.1%,周曉罡等，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008年03期）本文檔共39頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分2、培養(yǎng)條件生長素：2,4-D、NAA、IAA等細(xì)胞分裂素：6-BA、KT、ZT等本文檔共39頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分二、愈傷組織的形成過程(王凱基等1981）圖3-2油橄欖愈傷組織形成過程中各期細(xì)胞形態(tài)和RNA含量變化本文檔共39頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（一）誘導(dǎo)期（起動(dòng)期）誘導(dǎo)期又稱起動(dòng)期，指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期，是愈傷組織形成的起點(diǎn)。本文檔共39頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分CallusarisingfromleaftissueCallusarisingfromvasculartissue

FromrootFromembryoculture本文檔共39頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分Photoindicatingwherethecallus(c)arisesfrom

本文檔共39頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分外植體細(xì)胞在完整植株中隨著細(xì)胞的分化過程而逐漸停止分裂，開始執(zhí)行它們各自不同的功能。外植體細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，稱為靜止細(xì)胞。本文檔共39頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分1、特點(diǎn)①細(xì)胞的氣體交換迅速增加。②多聚核糖體不斷增加：截止M期前，每個(gè)細(xì)胞中的RNA含量增加到300％；③蛋白質(zhì)發(fā)生周期性的積累：每個(gè)分裂細(xì)胞的總增加量約為200％；④

酶活力也發(fā)生一定的變化：DNA聚合酶活力增加、與代謝有關(guān)的酶類，如己糖激酶和一些脫氫酶的活力也增加。⑤細(xì)胞的大小基本沒有變化。本文檔共39頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分2、誘導(dǎo)期的長短內(nèi)部：植物的種類、生理狀況外部：光照、外源激素因素決定。最常用的有2，4－D、NAA、IAA和細(xì)胞分裂素等。組織的機(jī)械損傷也作為一種刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂，愈傷組織往往出現(xiàn)在傷口處。有些天然提取物對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和維持十分有益，常用的有椰子汁（10％），0.5％的酵母提取物，5％～10％的番茄汁。Yeoman和Mitchell(1970)指出了核仁是生長物質(zhì)的作用部位。改善本文檔共39頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（二）分裂期（Celldivision）外植體(explant)中已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，外植體外層細(xì)胞出現(xiàn)了分裂，由于外層細(xì)胞的迅速分裂使得這些細(xì)胞的體積縮小，逐漸回復(fù)到分生組織狀態(tài)，因此也稱為回復(fù)變化。本文檔共39頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分1、分裂期細(xì)胞的特征①外層細(xì)胞進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。胡蘿卜組織培養(yǎng)7d后，細(xì)胞數(shù)可增加10倍。②

每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。③

細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。④核和核仁增大到最大。⑤RNA含量減少，而DNA含量保持不變。⑥隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長，組織的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極快。本文檔共39頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。2、愈傷組織的特征本文檔共39頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（三）分化期（Differentiation）停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化而形成由不同形態(tài)和功能的細(xì)胞組成的愈傷組織。本文檔共39頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分分化結(jié)構(gòu)的形成過程加速，超過了回復(fù)變化。外層細(xì)胞的分裂逐漸減慢，甚至停止，為次生生長所代替，大量次生結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。在這時(shí)期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小往往沒有變化。1、分化期特點(diǎn)本文檔共39頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分胡蘿卜愈傷組織2、愈傷組織的特點(diǎn)生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

本文檔共39頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分Callusmayhaveayellow,white,greenorred(anthocyanin花青苷)appearance.本文檔共39頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分第二節(jié)愈傷組織發(fā)生的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)

煙草愈傷組織在8周培養(yǎng)期間形態(tài)的變化（自桂耀林）本文檔共39頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分1、色澤：一般為淡黃色、綠色或白色，亦可為紅色。影響因素：葡萄糖的水平，可溶性淀粉的存在，缺氮、溫度、光及外源激素等營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素。黑暗中培養(yǎng)的煙草愈傷組織魔芋愈傷組織菠蘿的愈傷組織一、形態(tài)學(xué)本文檔共39頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分Callusexudingstickypoly-saccharides

2、質(zhì)地疏松致密Rhizogeniccallus

Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

Callustypes轉(zhuǎn)換2,4-D（備注）有機(jī)態(tài)的還原態(tài)氮銨態(tài)氮細(xì)胞懸浮系本文檔共39頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分二、細(xì)胞學(xué)

圖3-4圖解示致密愈傷組織和疏松愈傷組織(A)致密愈傷組織(B)疏松愈傷組織

1.巨大的細(xì)胞2.管狀細(xì)胞3.大的胞間隙愈傷組織并非完全由薄壁細(xì)胞組成。不同類型的愈傷組織在細(xì)胞組成上有明顯不同。在長期培養(yǎng)過程中，愈傷組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的變化及基因突變：染色體出現(xiàn)多倍體和非整倍體組培快繁的障礙

育種提供基礎(chǔ)本文檔共39頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分第三節(jié)愈傷組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生及體細(xì)胞胚胎發(fā)生（一）細(xì)胞的分化（維管組織）（二）器官的分化一、愈傷組織培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生本文檔共39頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（一）細(xì)胞的分化1、在培養(yǎng)中，已觀察到的細(xì)胞類型薄壁細(xì)胞分生細(xì)胞管胞色素細(xì)胞石細(xì)胞纖維細(xì)胞等，其中以維管組織（特別是木質(zhì)部）的分化最為常見。本文檔共39頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分2、影響維管組織分化的主要因素激素生長素：起到主要的作用，低濃度刺激木質(zhì)部分化。激動(dòng)素：可以增加愈傷組織中管胞形成的比例；激動(dòng)素和生長素協(xié)同增效作用BAP，2-iP和ZT也有一定的作用，但沒有證據(jù)證明他們的普遍性。蔗糖在丁香的組織培養(yǎng)中，當(dāng)生長素濃度不改變而變化蔗糖濃度時(shí)，在蔗糖濃度為1.5～2.5％的范圍時(shí)，愈傷組織內(nèi)僅形成木質(zhì)部；超過4％時(shí)則幾乎完全為韌皮部；在2.5～3.5％時(shí)，既形成木質(zhì)部也形成韌皮部。物理因素：研究較少。光、溫度對(duì)木質(zhì)部的形成有一定的影響。本文檔共39頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（二）器官分化1、通過器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的基本方式有3種（konar等，1972）芽根植株：普遍愈傷組織根芽植株：根有抑制芽產(chǎn)生的影響根和芽植株本文檔共39頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分2、影響因素激素2.4-D與KT：比例較高時(shí)，有利于莖的形成，反之，有利于根的形成。赤霉素（GA3）：抑制煙草、紫雪花（Plumbagoindica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。GA3的完全抑制作用只發(fā)生在黑暗條件下。乙烯：對(duì)芽的分化有一定作用，作用方向與植物種類和處理的時(shí)間有關(guān)。物理因素光強(qiáng)、光質(zhì)和光周期：一般光強(qiáng)為1000～15001x，光周期12～16h，近紫外和藍(lán)紫光促進(jìn)芽的發(fā)生，而紅光顯著促進(jìn)長根。溫度：25℃左右的培養(yǎng)溫度適于器官發(fā)生，但接近于植物原產(chǎn)地的生長溫度對(duì)培養(yǎng)物更有利。

本文檔共39頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（1）胚狀體：高等植物的體細(xì)胞在一定條件下所誘導(dǎo)形成的胚，稱為體細(xì)胞胚，即所謂的胚狀體。二、體細(xì)胞胚胎的形成1.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的幾個(gè)概念（2）胚狀體形成的5個(gè)階段：

原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚和子葉期。本文檔共39頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分（3）由胚狀體形成完整植株，與不定芽和根發(fā)生相比，有以下三個(gè)特征：

第一、具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端

分化芽端與根端，而不定芽或不定根都為單向極性;

第二、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)

系，而不定芽或不定根往往與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系；

第三、胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Y’形，而不定芽的維管

組織無此現(xiàn)象。本文檔共39頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分2、愈傷組織中胚狀體特征①二極性

在組織培養(yǎng)的器官發(fā)生過程中，愈傷組織是一團(tuán)無極性分化的細(xì)胞團(tuán)，器官分化中芽或根分化只是具單極性，而胚狀體在分化初期就具胚根和胚芽兩極，具明顯的形態(tài)特征上的極性（Polarity）類似于合子發(fā)育中的種子結(jié)構(gòu)。②生理隔離（physiologicalisolation）：指體細(xì)胞胚與母體組織或外植體的維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，胚狀體與周圍組織間形成縫隙，處于較獨(dú)立的狀態(tài)，盡管細(xì)胞組織間仍有胞間連絲存在，這是體細(xì)胞胚獲得營養(yǎng)，激素及能量來源的通道，其后這些細(xì)胞趨于解體。③遺傳穩(wěn)定胚狀體起源于單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，在其產(chǎn)生和發(fā)育過程中，一旦形成即通過了分化過程，結(jié)構(gòu)即穩(wěn)定無需較長時(shí)間的脫分化與再分化過程，細(xì)胞變異的頻率較低，成苗率較高，遺傳穩(wěn)定性好。④重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征誘導(dǎo)階段所形成的原胚或原胚團(tuán)，要轉(zhuǎn)入無激素的培養(yǎng)基中，使它進(jìn)一步分化發(fā)育，經(jīng)歷球形胚，心形胚，魚雷形及子葉形體胚的發(fā)育階段。本文檔共39頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分3.愈傷組織中胚狀體發(fā)生的部位可來自于外植體或愈傷組織表面的單細(xì)胞：較為常見可以發(fā)生在愈傷組織的內(nèi)部。本文檔共39頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分4.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式（1）由外植體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段如石龍芮再生植株莖表面長出不定胚，槐樹種子的子葉在組織培養(yǎng)過程中，可在切口處產(chǎn)生愈傷組織的同時(shí)，在子葉組織中分化出體細(xì)胞胚等。（2）外植體先愈傷化，然后由愈傷組織表面分化形成體細(xì)胞胚。本文檔共39頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\15點(diǎn)5分5.影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主要因素（1）外植體不同植物的基因型不同，在培養(yǎng)條件下形成體細(xì)胞胚的反應(yīng)各異。如柑橘類，胡蘿卜及矮牽牛等容易誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，但煙草卻難以發(fā)生體細(xì)胞胚。柑橘類中的甜橙易于胚胎發(fā)生，而寬皮橘較難，各種植物種子的子葉一般易于發(fā)生胚狀體。（2）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：主要是生長素在離體條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚的發(fā)育是一個(gè)包括兩個(gè)步驟的過程，每個(gè)步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的生長素是2,4-D，濃度范圍0.5～1mg/L.=====胚性細(xì)胞團(tuán)----繼代培養(yǎng)不能形成胚