胰島素生產(chǎn)流程圖

胰島素(E.Coli)生產(chǎn)流程

本文檔共17頁；當前第1頁；編輯于星期一\19點25分

本文檔共17頁；當前第2頁；編輯于星期一\19點25分人胰島素—碳水化合物代謝和體細胞供能一級結構：51個氨基酸雙鏈（A：21，B：30）分子量：5734g/mol等電點：5.4胰島素產(chǎn)生受損導致糖尿病本文檔共17頁；當前第3頁；編輯于星期一\19點25分人胰島素的制備方法人胰腺提取---原料來源有限通過單個氨基酸化學合成---生產(chǎn)成本太高豬胰島素轉化或“半合成”--成本高，來源少基因工程菌發(fā)酵--雙鏈—Genentech,開發(fā)，EliLilly放大--胰島素原（82個氨基酸，胰島素的前體）--分泌法（Yeast），NovoNordisk產(chǎn)業(yè)化

--細胞內(nèi)法（E.coli），表達121+82個氨基酸的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵體，EliLilly產(chǎn)業(yè)化本文檔共17頁；當前第4頁；編輯于星期一\19點25分E.Coli胰島素原法

轉化流程本文檔共17頁；當前第5頁；編輯于星期一\19點25分市場分析和設計基礎（2005）

糖尿病人數(shù)：美國1800萬，全世界億，年增長率3-4%胰島素年銷售額35-40億美元,由NovoNordisc、EliLilly和SanofiAventis三家壟斷每個患者每年購買胰島素的花費：$250-750每個病人每年平均用量：0.5克純胰島素對億患者，年需求75-100噸純胰島素目前年產(chǎn)量20-30噸純胰島素設計年產(chǎn)量：1800kg純胰島素，滿足350萬人年工作330天，每48小時生產(chǎn)一批次，每年160批次每批次發(fā)酵液體積：37.5立方米，發(fā)酵罐空罐體積：50立方米本文檔共17頁；當前第6頁；編輯于星期一\19點25分人重組胰島素（E.coli）生產(chǎn)流程發(fā)酵工段初回收工段反應工段終純化工段本文檔共17頁；當前第7頁；編輯于星期一\19點25分本文檔共17頁；當前第8頁；編輯于星期一\19點25分通氣量：0.5VVM空罐體積：50立方米前接2級種子罐發(fā)酵周期：18小時發(fā)酵溫度：37度終菌密度：30克（干重）/升包涵體含量：干重的20%終保溫：10度發(fā)酵工段本文檔共17頁；當前第9頁；編輯于星期一\19點25分初回收工段—物料溫度保持10度--三個平行的碟片式離心機收獲菌體--菌液從37000L濃縮到9165L菌泥--菌體收率98%加與菌泥等體積的緩沖液(96.4%w/wWFI注射用水,0.7%EDTA,和2.9%TRIS-base)稀釋,有利于菌體碎片與包涵體分離三次高壓勻漿機破菌釋放包涵體壓降800bar終物料體積：1400L用前面的碟片式離心機回收包涵體收率98%加2倍體積的清洗劑(0.66%Triton-X100),洗滌包涵體本文檔共17頁；當前第10頁；編輯于星期一\19點25分反應工段—溶解包涵體玻璃反應釜內(nèi)加終濃度為300g/L(5M)的尿素（溶解變性蛋白）和40g/L的2-巰基乙醇（減少二硫鍵的結合）反應時間：8小時溶解收率：95%包涵體內(nèi)Trp-LE’-Met-proinsulin含量

：80%w/wWFI透析6小時，收率98%，去除尿素和2-巰基乙醇過濾去除細小顆粒，保護后續(xù)層析柱。終體積5200L再次離心，去除菌體碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片離心機本文檔共17頁；當前第11頁；編輯于星期一\19點25分反應工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解為121個氨基酸的Trp-LE’-Met和82個氨基酸的Proinsulin70%甲酸溶液30倍過量加入CNBr(理論摩爾比1:1)收率95%反應時間：12小時反應溫度：20度利用前面溶解反應釜在CNBr沸點35度旋轉真空蒸發(fā)1小時會產(chǎn)生少量有毒氰化物氣體，現(xiàn)場應準備次氯酸鹽亞硫酸分解的目的是打開胰島素原和二硫鍵，給半胱氨酸加上SO3部分pH9-11，50%w/w(6M)鹽酸胍，0.35%碳酸氫銨，3%硫酸鈉，1.5%過硫酸鈉，反應時間12小時，收率95%WFI透析至鹽酸胍濃度為20%w/w共用前面包涵體溶解過程的透析器本文檔共17頁；當前第12頁；編輯于星期一\19點25分反應工段—再折疊三個平行陽離子交換層析床純化proinsulin床直徑：140cm床高度：25cm填料：SPSepharoseFF,GE洗脫液：29%w/w尿素，1.5%NaCl,69.5%WFIpH4收率90%再折疊的目的是去除SO3，然后使二硫鍵形成，并再折疊成胰島素原的正確天然結構加入巰基乙醇本文檔共17頁；當前第13頁；編輯于星期一\19點25分反應工段—酶轉化本文檔共17頁