短期、亞慢性和慢性毒性

短期、亞慢性(mànxìng)和慢性(mànxìng)毒性作用第一頁，共七十六頁。1編輯課件急性毒性試驗的局限性：1.外源性化學物在長期重復染毒時可產(chǎn)生與急性毒性試驗完全不同的毒作用。如：苯2.動物的衰老(shuāilǎo)可影響毒作用的性質(zhì)和程度3.許多重要疾病均與年齡增長有關(guān)一、概述第二頁，共七十六頁。2編輯課件分類1.重復劑量毒性(dúxìnɡ)作用（短期）2.亞慢性毒性作用3.慢性毒性作用第三頁，共七十六頁。3編輯課件（一）蓄積(xùjī)作用

1.蓄積作用(accumulation)：當外源化學物連續(xù)地、反復地進入機體，而且吸收速度（或總量）超過代謝轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)和排泄的速度（或總量）時，化學毒物或其代謝物在機體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象為化學毒物的蓄積作用。蓄積作用是發(fā)生亞慢性、慢性毒作用的前提第四頁，共七十六頁。4編輯課件

2.儲存庫（depot）：化學毒物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫。機體常見的儲存庫有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼(gǔgé)等。如骨骼為鉛的儲存庫。蓄積形式:原形代謝產(chǎn)物結(jié)合形式第五頁，共七十六頁。5編輯課件3.蓄積(xùjī)的分類：物質(zhì)(wùzhì)蓄積功能蓄積

第六頁，共七十六頁。6編輯課件3.1物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：化學毒物反復(fǎnfù)多次染毒實驗動物后，用化學分析方法能測得機體內(nèi)或某些器官組織內(nèi)存在該化合物的原型或其代謝產(chǎn)物。第七頁，共七十六頁。7編輯課件3.2功能蓄積（functionalaccumulation）：化學毒物反復多次染毒實驗動物后，機體內(nèi)雖不能檢出化學毒物，然而機體可以出現(xiàn)慢性(mànxìng)中毒現(xiàn)象。注：功能蓄積是損害效應累計的結(jié)果。也可能是由于存留的化學毒物或代謝物數(shù)量極微，目前技術(shù)方法尚不能檢出的一種物質(zhì)蓄積，或者物質(zhì)蓄積與功能蓄積兼而有之第八頁，共七十六頁。8編輯課件（二）蓄積(xùjī)作用的意義

毒理學中，評價化學毒物有無蓄積作用，有助于：1.化學毒物是否引起潛在的慢性毒性依據(jù)2.制定(zhìdìng)衛(wèi)生限量標準時選擇安全系數(shù)的一種依據(jù)第九頁，共七十六頁。9編輯課件（三）蓄積(xùjī)作用的研究方法

1、蓄積系數(shù)(xìshù)法（accumulationcoefficient）

2、生物半減期法（biologicalhalf-life,t1/2）第十頁，共七十六頁。10編輯課件1蓄積(xùjī)系數(shù)法

1.1蓄積系數(shù)法：以生物效應為指標，用經(jīng)驗系數(shù)（K）評價蓄積作用的方法，即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的毒性效應（或死亡）進行比較

K是指多次接觸達到(dádào)預期效應的累計劑量與一次接觸能出現(xiàn)相同效應劑量的比值。K=ED50（n）/ED50(1)如果以動物死亡一半為效應指標，則K=LD50（n）/LD50(1)

第十一頁，共七十六頁。11編輯課件

K值越小：表示化學物的蓄積性越大K<1實驗動物對化學毒物發(fā)生過敏

K=1化合物在體內(nèi)完全蓄積(xùjī)或每次染毒后毒效應疊加

K>=5化合物蓄積性弱第十二頁，共七十六頁。12編輯課件蓄積(xùjī)系數(shù)分級標準蓄積系數(shù)（K）蓄積毒級分級<1高度蓄積1～明顯蓄積3～中等蓄積5～輕度蓄積第十三頁，共七十六頁。13編輯課件1.2蓄積(xùjī)系數(shù)法常用試驗方案

A固定(gùdìng)劑量法B劑量遞增法

C劑量固定的20天蓄積法第十四頁，共七十六頁。14編輯課件A固定(gùdìng)劑量法

在事先求出毒物的LD50的前提下，選取相同條件的40只（或更多）動物，隨即(suíjí)分為2組：實驗組和對照組。每組至少20只，雌雄各半。在1/20～1/5LD50之間選擇一個固定劑量，每日固定劑量、定時和相同途徑染毒試驗組累計發(fā)生一半動物死亡。如接觸劑量已累計達5個LD50，也可終止。實驗期限最短為25天（1/5LD50），最長100天（1/20LD50）第十五頁，共七十六頁。15編輯課件常用大鼠或小鼠染毒途徑多用灌胃或者腹腔(fùqiāng)注射第十六頁，共七十六頁。16編輯課件B劑量(jìliàng)遞增法

動物及分組：常用大或小鼠，40（或更多）分染毒組和對照組，每組至少20只，雌雄各半。終止時間：試驗組累計發(fā)生(fāshēng)一半動物死亡。在第21天也可結(jié)束，因累計劑量已達5.26LD50。第十七頁，共七十六頁。17編輯課件C劑量(jìliàng)遞增20天法：

動物分組：1/20LD50、1/10LD50、1/5LD50、1/2LD50和對照組5個組，每組10只，雌雄各半。每日染毒一次，連續(xù)20天評定標準：（1）各劑量(jìliàng)組均無死亡，蓄積性不明顯；（2）僅1/2LD50劑量組有死亡，其他組無死亡，則為弱蓄積性；（3）若1/20LD50劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應關(guān)系，則為中等蓄積性；（4）若1/20LD50劑量組有死亡，且有劑量反應關(guān)系，則為強蓄積性。第十八頁，共七十六頁。18編輯課件1.4局限性

1.對于具有免疫毒性的物質(zhì)不適用2.不能判斷化學毒物的蓄積是物質(zhì)蓄積或功能蓄積3.蓄積系數(shù)法，以死亡為指標，用LD50表示生物效應，有急性(jíxìng)試驗的局限性，可能漏檢某些指標。

第十九頁，共七十六頁。19編輯課件2、生物(shēngwù)半減期法是利用毒物動力學原理闡明化學毒物在機體內(nèi)的蓄積作用(zuòyòng)特征。原理：機體內(nèi)蓄積的速度和量與單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速度和量，以及清除的速度和量有關(guān)。t1/2反映物質(zhì)從機體內(nèi)清除速度的參數(shù)，理論上，在等間距離接觸下，6個生物半減期即可達極限值98.4%。第二十頁，共七十六頁。20編輯課件t1/2越大，在機體內(nèi)蓄積的可能性越大t1/2越小，到達極限(jíxiàn)的時間越短蓄積極限值＝1.44×t1/2×每日接觸量第二十一頁，共七十六頁。21編輯課件（二）基本概念

第二十二頁，共七十六頁。22編輯課件1.短期重復劑量毒性指實驗動物或人連續(xù)接觸(jiēchù)外源化學物14-30天所產(chǎn)生的中毒效應。第二十三頁，共七十六頁。23編輯課件2.亞慢性毒性（subchronictoxicity）：是指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)較長期(chángqī)接觸某一外源化學毒物所出現(xiàn)的中毒效應。一般在相當于1/10左右生命時間（壽命）內(nèi)亞慢性毒性試驗：指在實驗動物的1/10左右（如大鼠3個月）的生命時間內(nèi)，反復多次給予低劑量化學毒物，觀察試驗動物有無引起有害作用的試驗過程。第二十四頁，共七十六頁。24編輯課件

3.慢性毒性（chronictoxicity）：是指人或?qū)嶒瀯游镩L期（甚至終生）反復接觸低劑量的化學毒物所產(chǎn)生(chǎnshēng)的毒性效應。一般2年慢性毒性試驗：在受試動物生命的大部分或終生，連續(xù)長期給予低劑量的受試物，觀察有無引起有害作用的試驗過程。第二十五頁，共七十六頁。25編輯課件第二十六頁，共七十六頁。26編輯課件試驗(shìyàn)目的1.觀察長期(chángqī)接觸受試物的毒性效應譜、毒作用特點和靶器官；了解其毒性機制。

2.觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性第二十七頁，共七十六頁。27編輯課件可逆毒性:是指停止接觸后可逐漸消失的毒性作用。一般情況下，機體接觸毒物的濃度越低、時間越短、損傷越輕，則脫離接觸后其毒性作用消失的越快。不可逆毒性是指停止接觸后其毒性作用依然存在甚至對機體造成的損害作用進一步加深。注：

一種毒物引起的組織病理學損傷，其再生能力在很大程度上決定于毒性效應的可逆和不可逆性有些毒物所造成的損害是不可逆的，如損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)多數(shù)是不可逆的，因為(yīnwèi)已分化的中樞神經(jīng)細胞不能再分裂

第二十八頁，共七十六頁。28編輯課件4.確定(quèdìng)不同動物對受試物的毒效應的差異，為將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。3.研究重復接觸受試物毒性作用的劑量-反應（效應）關(guān)系，從初步了解到確定未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL），為制定(zhìdìng)人類接觸的安全限量提供參考值第二十九頁，共七十六頁。29編輯課件二、研究(yánjiū)方法（一）實驗設計第三十頁，共七十六頁。30編輯課件

1實驗(shíyàn)動物選擇

（1）物種(wùzhǒng)和品系

第三十一頁，共七十六頁。31編輯課件急性原則：*盡量選擇急性毒性反應(fǎnyìng)與人近似的動物；*易于飼養(yǎng)管理、試驗操作方便的動物；*繁殖生育能力較強，數(shù)量較大能夠保障供應；*價格較低，易與獲得的動物。亞慢性原則：*理論上，選取對化學毒物代謝過程、生理反應和生化特性基本上與人接近，且在急性試驗中證明是對化學毒物敏感(mǐngǎn)的物種和品系實際上，常用大鼠犬豚鼠第三十二頁，共七十六頁。32編輯課件

（2）性別、年齡和數(shù)量雌雄各半；剛斷乳的動物：大鼠6－8周齡（80-100g），同組動物體重不超過10%、組間平均(píngjūn)體重不超過5%大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴不少于6只，要求試驗結(jié)束時，活的動物數(shù)能保證統(tǒng)計學處理。第三十三頁，共七十六頁。33編輯課件

亞慢性毒性試驗

年齡(niánlíng)：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：小動物≥20大動物≥6性別：雌雄各半

慢性毒性試驗年齡：大鼠50~70g狗<8月小鼠初斷乳數(shù)量：小動物≥40大動物≥8性別：雌雄(cíxióng)各半第三十四頁，共七十六頁。34編輯課件（3）微生物學寄生蟲學等級和飼養(yǎng)(sìyǎng)環(huán)境應選擇清潔(qīngjié)級及以上等級動物動物室：清潔、溫度22oC±3，濕度30-70%，人工控制晝夜交替籠具：大小適中、動物能自由活動飼料：營養(yǎng)合理飲用水：清潔、充足第三十五頁，共七十六頁。35編輯課件

2染毒方式(fāngshì)與期限

染毒方式(fāngshì)原則：1）盡量選用與人群實際接觸相同的途徑和方式食品、藥品、環(huán)境污染物2）并與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種途徑染毒，每日一次，連續(xù)給予第三十六頁，共七十六頁。36編輯課件染毒期限

取決于實驗具體(jùtǐ)要求和所選擇的實驗動物

工業(yè)毒理學——3－6個月食品毒理學——6個月－1年環(huán)境毒理學——6個月－1年致癌試驗——接近(jiējìn)或等于動物的預期壽命第三十七頁，共七十六頁。37編輯課件注意的問題：（1）小動物：灌胃或喂飼法大動物：膠囊法或灌胃法喂飼法注意：混合均勻受試物穩(wěn)定保證營養(yǎng)受試物摻入量嚴格(yángé)規(guī)定第三十八頁，共七十六頁。38編輯課件（2）呼吸道染毒(rǎndú)染毒時間：2-6h/d亞慢性：4小時慢性試驗：間歇性：工業(yè)毒物6-8小時連續(xù)性：環(huán)境接觸22-24小時第三十九頁，共七十六頁。39編輯課件（3）注射(zhùshè)（4）最好結(jié)合毒物動力學血藥濃度的監(jiān)測，以保持生物學效應的每日相似性第四十頁，共七十六頁。40編輯課件3劑量(jìliàng)選擇和分組

（1）分組：原則：一般設3個試驗組和1個陰性（溶劑）對照組。

最高劑量組：要求出現(xiàn)明顯(míngxiǎn)的中毒癥狀或某些觀察指標發(fā)生明顯(míngxiǎn)變化，但動物不死亡，即使有死亡，不超過10%

最低劑量組：應無中毒反應或極輕微反應（NOAEL)。

中劑量組相：當于觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)

高、中、低劑量組距以3－10倍為宜，不少于2倍第四十一頁，共七十六頁。41編輯課件（2）劑量(jìliàng)設計：

①以相同物種的短期毒性資料為依據(jù)。

亞慢性毒性試驗可依據(jù)急性毒性的閾劑量或以1/20～1/5LD50確定；慢性毒性試驗以亞慢性毒性試驗效應的最大耐受量（MTD）為最高劑量。

劑量選擇步驟：急性亞急性亞慢性慢性

第四十二頁，共七十六頁。42編輯課件

②對于人群(rénqún)主動攝入的食品和藥品，可采用人體可能接觸的最高劑量為劑量設計依據(jù)大鼠：3個劑量組：1030100非嚙齒類：3個劑量組：51550根據(jù)(gēnjù)專業(yè)特殊性和管理部門有所區(qū)別第四十三頁，共七十六頁。43編輯課件亞慢性毒性的劑量選擇(xuǎnzé)陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組急性毒性的閾劑量1/20~1/5LD50組距：3~10倍，最低不小于2倍慢性毒性的劑量(jìliàng)選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組亞慢性閾劑量或其1/5~1/2

1/10

LD50組距：2~5倍，最低不小于2倍第四十四頁，共七十六頁。44編輯課件4觀察(guānchá)指標第四十五頁，共七十六頁。45編輯課件（1）一般(yībān)觀察1）進食量、外觀體征、行為活動綜合性指標初步判斷作用(zuòyòng)部位、損害程度第四十六頁，共七十六頁。46編輯課件2）動物體重：

體重的增長情況是綜合反映動物健康狀況最基本的靈敏指標之一，受食欲、消化功能、代謝和能量消化變化的影響。如發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)實驗組動物體重增長減慢，停止或減輕，在排除由于異味引起食欲不佳的前提下，可說明化學毒物的毒性效應。表示方法：（1）體重絕對增長量（2）體重增長百分率（10％）（3）劑量-反應關(guān)系第四十七頁，共七十六頁。47編輯課件

3）飼料消耗量：食物利用率：動物每攝入100g飼料所增長的體重克數(shù)（g體重/100g飼料）評價：食物利用率有助于了解化合物毒性效應觀察(guānchá)內(nèi)容：影響食欲影響食物的吸收、代謝食物利用率＝體重增長/進食量

第四十八頁，共七十六頁。48編輯課件（2）實驗室監(jiān)測項目血、尿常規(guī)和血液生化指標目的：發(fā)現(xiàn)受試物所致(suǒzhì)器官損傷和器官紊亂檢查重點：肝臟、腎臟、血液第四十九頁，共七十六頁。49編輯課件1）血液學檢查包括紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)及分類、凝血時間(shíjiān)等2）血液生化檢查（針對肝臟、腎臟及相關(guān)可能靶部位選擇）注：一般只需在實際結(jié)束后處死動物采血檢驗如需在實驗過程中采集血樣，最大采血量不能超過總血量的10%3）尿液第五十頁，共七十六頁。50編輯課件（3）系統(tǒng)尸解和組織病理學1）臟器重量和臟器系數(shù)：臟器系數(shù)（比）：指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占的質(zhì)量。在不同的年齡期，實驗動物各個臟器與體重比值有一定(yīdìng)規(guī)律，若化學毒物使某個臟器受損，其比值會發(fā)生變化，是一項靈敏、有效和經(jīng)濟的指標。第五十一頁，共七十六頁。51編輯課件臟器系數(shù)增大：增生、充血(chōngxuè)、水腫

臟器系數(shù)減?。号K器發(fā)育不良、萎縮第五十二頁，共七十六頁。52編輯課件尸解對象：實驗過程中死亡的或者(huòzhě)試驗結(jié)束后未死亡的觀察的主要臟器：心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、卵巢（睪丸）、腦等第五十三頁，共七十六頁。53編輯課件2）病理學檢查(jiǎnchá)

目的：確定化合物對毒作用的靶部位，損傷的性質(zhì)和程度，從病理學角度尋找化學毒物與病理改變的劑量－效應關(guān)系，為了解化合物的毒效應及機制提供依據(jù)(yījù)。檢查內(nèi)容：大體檢查、常規(guī)病理組織學檢查、酶組織化學化學檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結(jié)構(gòu)檢查。

第五十四頁，共七十六頁。54編輯課件常規(guī)病理(bìnglǐ)組織學檢查

HE染色原理(yuánlǐ)：蘇木素-伊紅染色，又叫常規(guī)染色和普通染色。主要用來顯示各種組織正常成分和病變的一般形態(tài)，進行總體觀察。第五十五頁，共七十六頁。55編輯課件免疫(miǎnyì)組織化學法

間接(jiànjiē)免疫熒光法親合素-生物素技術(shù)第五十六頁，共七十六頁。56編輯課件間接(jiànjiē)免疫熒光法原理抗原與一抗結(jié)合和，再用標記熒光色素(sèsù)的二抗與第一抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光來間接顯現(xiàn)抗原。第五十七頁，共七十六頁。57編輯課件第五十八頁，共七十六頁。58編輯課件親合素-生物素技術(shù)(jìshù)原理

親合素又稱卵蛋白素，是從卵蛋白中提取的一種糖蛋白，每個親合素上有4個與生物素分子結(jié)合力極高的位點，兩者間的親和力比抗原抗體大100萬倍。第二抗體結(jié)合上生物素，變?yōu)樯锼鼗贵w。再將親合素與過氧化酶標生物素結(jié)合在一起(yīqǐ)，形成親合素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC復合物）。

第五十九頁，共七十六頁。59編輯課件親合素-生物素技術(shù)(jìshù)第六十頁，共七十六頁。60編輯課件第六十一頁，共七十六頁。61編輯課件（4）可逆性檢查

最后一次給藥后24h，每組活殺部分動物（如2/3），檢測(jiǎncè)各項指標，余下動物停止染毒，繼續(xù)觀察2-4周。重點觀察毒性反應器官，以了解毒性反應的可逆性和可能出現(xiàn)的遲緩性毒性第六十二頁，共七十六頁。62編輯課件（5）指標觀察(guānchá)時間

一般狀況和癥狀，每天觀察一次每周記錄飼料消耗量和動物體重各一次實驗時間≤3個月實驗時間＞3個月第六十三頁，共七十六頁。63編輯課件（6）特異性指標及其它特異性指標是指能反映(fǎnyìng)毒物對機體毒作用本質(zhì)的特征性指標，常與其毒作用機制有關(guān)，有時可作為效應生物學標志。對神經(jīng)行為的檢查神經(jīng)系統(tǒng)心電圖、血壓心血管系統(tǒng)

第六十四頁，共七十六頁。64編輯課件（二）長期(chángqī)毒性試驗的注意事項第六十五頁，共七十六頁。65編輯課件重視實驗項目管理合理的實驗設計劑量設置(shèzhì)合理獲得明確的劑量-反應關(guān)系，理想的NOAEL、LOAEL第六十六頁，共七十六頁。66編輯課件3.試驗(shìyàn)動物環(huán)境的要求4.檢測條件的控制第六十七頁，共七十六頁。67編輯課件三、結(jié)果評價

（一）明確觀察指標(zhǐbiāo)是否有差異1.劑量相關(guān)性分析2.反應重現(xiàn)性第六十八頁，共七十六頁。68編輯課件3.相關(guān)指標的變化4.差異(chāyì)大小和性別差異(chāyì)5.歷史性對照的作用第六十九頁，共七十六頁。69編輯課件（二）差異是否代表(dàibiǎo)有害效應第七十頁，共七十六頁。70編輯課件化學品毒性鑒定(jiàndìng)程序和方法

1）第一階段（急性毒性試驗、眼刺激試驗和皮膚刺激試驗）

主要是急性毒性參數(shù)的測定和了解受試樣品對皮膚、粘膜的刺激性以及致敏性，為毒性分級和標簽(biāoqiān)管理提供依據(jù)。同時，可了解受試樣品對機體造成急性損害的可能性和嚴重程度，并為第二階段各項試驗的劑量設計提供依據(jù)。在測定LD50時，一般要求用兩種動物，染毒途徑應包括所有人體可能的接觸途徑。

第七十一頁，共七十六