三種熒光定量PCR檢測方法比較

./三種熒光定量PCR檢測方法比較定量pcr：以參照物為標準,對PCR終產(chǎn)物進行分析或?qū)CR過程進行監(jiān)測,從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù),稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數(shù)期進行的。常見熒光定量PCR檢測方法可分為以下幾類：<1>SYBRGreenI檢測模式SYBRGreenI是一種能與雙鏈DNA結合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結合后,熒光大大增強。因此,SYBRGreenI的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關,可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm,發(fā)射波長最大約為520nm。PCR擴增程序一般為94℃～55℃～72℃三步法,40個循環(huán)。SYBRGreenI的缺點：由于SYBRGreenI沒有特異性,不能識別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會結合發(fā)光,對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光,通常本底較高,所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。SYBRGreenI的優(yōu)點：SYBRGreenI的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生,由于它能所有的雙鏈DNA相結合,所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針,通用性較好,并且價格相對較低。這對科研是很有利的,因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。<2>水解探針模式<taqman探針>TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,熒光基團連接在探針的5’末端,而淬滅劑則在3’末端。當探針與靶序列配對時,熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進行延伸反應時,聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷,使得熒光基團與淬滅劑分離,發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團不斷積累。因此Taqman探針檢測的是積累熒光。PCR擴增程序通常是：94℃～60℃40個循環(huán)。常用的熒光基團是FAM,TET,VIC,HEX。<3>雜交探針模式<Beacon、FRET>分子信標是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補配對,因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅,由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的莖環(huán)結構中,環(huán)一般為15-30個核苷酸長,并與目標序列互補;莖一般5-7個核苷酸長,并相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的一端,而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下,因為模板不存在時形成莖環(huán)結構,當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開,如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后,分子信標將成鏈狀而非發(fā)夾狀,使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時,因淬滅作用被解除,發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在,分子信標也是積累熒光。常用的熒光基團：FAM,TexasRed。PCR擴增程序通常是：94～55～72℃三步法,40個循環(huán)。FRET探針又稱雙雜交探針,FRET探針由兩條相鄰探針組成,在一條探針的5`端標記FAM熒光基團,另一探針的3`端標記Red640熒光基團。當復性時,探針結合在模板上,FAM基團和Red640基團相鄰,激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光,作為Red640基團的激發(fā)光被吸收,使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當變性時,探針游離,兩基團距離遠,不能產(chǎn)生640波長的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光,所以檢測信號是實時信號,非累積信號。常用的熒光基團是：LC-Red640,LC-Red705。能用于實時熒光PCR定量的方法很多,各有優(yōu)缺點,應根據(jù)實驗的需要和當前的實驗條件選擇適合自己的方法。下面為各種方法的比較：實驗中的一些好習慣：加入試劑之前,把它混勻一下,以免放置時間長了濃度不均;移液槍用完之后要歸到最大計量的位置,防止久而久之彈簧失去彈性。一定要記著關水浴箱,切記切記;多和大家討論,同時多關注別人討論的經(jīng)驗,這幾乎是最快提高的捷徑了;所有的試劑都自己配,出了問題才好找原因。防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗<注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用>。3.有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專用實驗室,所有器械等應為專用。常用的RNA酶抑制劑：1.焦磷酸二乙酯<DEPC>：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑<RNasin>：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。因為DEPC不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,因此在分離和純化RNA過程中不能使用,而且它與一些緩沖液<例如Tri>不能相容在所有RNA實驗中,最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶<RNA酶>的污染。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。研究人員造成的污染RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進行RNA實驗時應勤換手套。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理動植物總RNA提取-Trizol法：Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析,斑點雜交,Poly<A>+分離,體外翻譯,RNase封阻分析和分子克隆。1.將組織在液N中磨成粉末后,再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨,注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2.研磨液室溫放置5分鐘,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒。3.取上層水相于一新的離心管,按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘。4.棄去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,渦旋混勻,4℃下7500g離心5分鐘。5.小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,必要時可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]1.整個操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。另外,提取上清這步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然會有蛋白質(zhì)污染,影響比值2.加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。總mRNA的提取經(jīng)驗：一、關于TrizolReagent需要的試劑1.Chloroform：氯仿<分析純>2.Isoproplylalcohol：異丙醇<分析純>3.75%Ethanol<inDEPC-treatedwater>：75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。4.RNase-freewater：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%<V/V>加在dH2O中500ml<50ul>,在37℃過夜,并高壓滅菌即得<150℃3小時>5.一次性塑料手套6.注意：DEPC有致癌之嫌二、關于TrizolReagent的使用過程：1.Homogenization<勻漿>a.Tissues：組織每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑,樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。b.CellsGrowninmonolayer<單層細胞接毒后出現(xiàn)病變的>針對JEV細胞總RNA的抽提法：BHK21細胞長成單層后,接毒0.5-1ml<采用大瓶>,37℃吸附1h,倒掉,加維持液<含2%的血清和HEPE8的MEM>約5ml,維持天。出現(xiàn)75%-100%的病變時,以PBS<預冷>沖洗細胞兩次,直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2,吹吸幾次,以裂解細胞<細胞瓶有兩種常用規(guī)格：大的約45cm2,小的約30cm2,故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定,以蓋滿瓶底為度,而不是依據(jù)細胞的數(shù)量,否則可導致DNA的污染>具體方法如下：<樣品一定要新鮮><1>組織接入預冷的EP管中,加入Trizol試劑1ml/10cm2<量一定要加足,否則易污染>,混勻,吹吸幾次,以破裂細胞,置室溫5min,以使核蛋白復合物徹底分離。<2>加氯仿0.2ml<每1mlTrizol試劑加入氯仿0.2ml>,蓋好,劇烈震蕩15s,置室溫2-3分鐘。<3>4℃離心,10000g×15min,離心后,混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中,水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%。<4>仔細吸取上層水相,移至另一EP管中。<5>加0.5ml異丙醇,以沉淀RNA<每1mlTrizol試劑加入0.5ml異丙醇>,置室溫10min。<6>4℃離心,10000g×10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。<7>棄上清液,加入預冷的75%乙醇1ml<每1mlTrizol試劑加入75%乙醇至少1ml>,震蕩,充分洗滌沉淀,4℃離心,5500g×5min。棄上清液,空氣干燥<或真空干燥>后,沉淀重懸于無RnasedH2O中,吹吸幾次,55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA,-70℃保存?zhèn)溆谩?lt;8>抽提出的細胞總RNA干燥后加水50ul,取10ul加無Rnase水990ul,稀釋100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以無Rnase水為對照,在721型紫外分光光度計下檢測,結果應為：A260/280ratio<1.6。<9>分離組織10mg<純組織>加800ulTrizol試劑。<10>擴增產(chǎn)物的鑒定。DEPC處理方法如下：1.DEPC處理：<1>DEPC水：100ml超純水加入0.2mlDEPC,充分混勻,高壓滅菌。<2>Tip頭<槍頭>、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材<包括1ml、200μl、20μlTip頭;EP管和PCR反應管等>：用0.1%的DEPC水<1000ml超純水加入1mlDEPC>37℃浸泡過夜,高壓滅菌。2.提取RNA,用DEPC水溶解。3.RT：我是用PCR儀來控制溫度和時間的,所以RT是在PCR反應管中作的。4.操作過程中要戴一次性手套,并經(jīng)常換手套。最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下,槍頭盒插好槍頭后,加入1-2ml的0.1%DEPC水,在滅菌就行了;現(xiàn)在有進口的RNASEFREE的槍頭買,直接用不用處理的。如何消除污染：機器運行完后,取出PCR產(chǎn)物時不能隨便丟棄,應該用塑料手套或其他打結包好后丟入垃圾桶。<1>試劑：mixer盡量分裝,不要原瓶多次取用。<2>加樣：原則是DNA最后加,其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同,那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面,混合均勻之后再分裝到各個管子里去,這樣可以有效地避免誤差及污染。另外,普通實驗室容易污染,且污染程度很高,與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系,最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。目前,國內(nèi)外各個公司提供的診斷試劑盒大多采用了UNG來防污染。Uracil-DNAN-glycosylase<UNG>尿嘧啶DNA糖基酶,來源于大腸桿菌重組克隆表達。RNA定量：RNA也最好至少要用電泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。RNA的貯藏,最主要的是溫度,-20不夠,最好-80,液氮最保險。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響。RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進行一步法進行;若條件不太好的話可分兩步進行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。兩步法的結果更加理想,條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象,由此推測是體系更加單一比較利于PCR的進行。一定要做內(nèi)參的,不作內(nèi)參的結果是不可信的。電泳可以不一起跑,沒有關系,計算的是相對表達程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量,不是絕對表達量mRNA的分離與純化中。步驟<4>中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個,一個是破壞RNA的二級結構,尤其是mRNAPoly<A+>尾處的二級結構,使Poly<A+>尾充分暴露,從而提高Poly<A+>RNA的回收率;另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合,否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。下面,我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。保溫試驗：方法很簡單的,按照樣品濃度,從RNA溶液中吸取兩份1000ng的RNA加入至0.5ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10ul的總體積,然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。時間到了之后,取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后,比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別<當然,它們的條帶也要符合方法2中的條件>,則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染,RNA的質(zhì)量很好。相反的,如果70℃保溫的樣本有明顯的降解,則說明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染與對策：PCR擴增產(chǎn)物污染.這是PCR反應中最主要最常見的污染問題,所以,擴增區(qū)的儀器什么如槍頭等要注意。還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時