中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立與推廣

中藥鑒定創(chuàng)新方法體系的建立與推廣

DNAbarcodingsystemforherbalmaterials

陳士林ShilinChen中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥鑒定技術(shù)瓶頸

一萬余種中藥材物種鑒定品種混亂傳統(tǒng)四大鑒定方法體系的局限路在何方？基原鑒定形態(tài)鑒定顯微鑒定理化鑒定DNA條形碼中藥鑒定領(lǐng)域的變革與突破經(jīng)典中藥鑒定方法難以滿足現(xiàn)代需求鑒定方法缺失導(dǎo)致嚴(yán)重安全性事件

--關(guān)木通誤當(dāng)木通服用，導(dǎo)致急性腎功能衰竭（馬兜鈴酸腎病事件）

--土三七誤當(dāng)三七服用，導(dǎo)致嚴(yán)重肝毒性Hoangetal.ScienceTranslationalMedicine,2013,5:197ra102.NortierJL,MartinezMCM,SchmeiserHH,etal.NewEnglandJournalofMedicine,2000,342(23):1686-1692.關(guān)木通百度百科木通中藥材天地網(wǎng)DNAbarcodingcanachievearapidandaccurateidentificationforherbsApowerfultoolforidentifyingmedicinalplantsandtraditionalChinesemedicinalmaterialsAbruscantoniensis

Abrusprecatorius

MedicinalplantsChineseherbalmedicinesDNAbarcodingtechnologyusesashortandstandardizedgeneregiontoidentifyspeciesOnesequenceOnespecies課題組首次提出并驗(yàn)證ITS2條形碼，引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注

國際期刊PLoSONE關(guān)注藥用植物DNA條形碼。該文提出ITS2序列為藥用植物通用的條形碼序列，為陸地植物DNA條形碼序列篩選提出了新的視角，由此引起同行的關(guān)注和討論。被德國專業(yè)網(wǎng)站選為近25年來在ITS2領(lǐng)域最受關(guān)注的16篇文章之一http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/該文發(fā)表后3年引文288次首次驗(yàn)證ITS2為藥用植物鑒定通用條形碼通過研究比較psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2和

ITS等七個候選DNA條形碼，發(fā)現(xiàn)ITS2是最佳條形碼序列ITS2長度約230bp，易于擴(kuò)增和測序，物種鑒定能力強(qiáng)，適合中藥材等存在DNA降解材料的鑒定人參、西洋參、羌活、寬葉羌活DNA條形碼鑒定方法正在納入國家藥典

Relativedistributionofinter-specificdivergencebetweencongenericspeciesandintra-specificvariationforfourloci.Thetwobarsineachboxrepresentinter-specific(above)andintra-specific(below)geneticdistances.IdentificationofthefamilyRosaceaeW+W-RelativeRanks,n,PvalueResultITS2matKW+=703,W-=0,n=37,P≤1.139×10-7ITS2>matKITS2rbcLW+=703,W-=0,n=37,P≤1.137×10-7ITS2>rbcLITS2rpoC1W+=703,W-=0,n=37,P≤1.133×10-7ITS2>rpoC1matKrbcLW+=620,W-=46,n=36,P≤6.479×10-6matK>rbcLmatKrpoC1W+=655,W-=11,n=36,P≤4.174×10-7matK>rpoC1rbcLrpoC1W+=359,W-=106,n=30,P≤0.009rbcL>rpoC1Wilcoxonsigned-ranktestsofinter-specificdivergenceamongloci.ITS2andrbcL,matK,rpoC1werecompared.For54samplesfrom43speciesin19diversegenera,thesuccessfulidentificationratewithITS2was100%,followedbymatK(94%)andrbcL(65%).

For1410samplesfrom893speciesin96genera

No.ofgenera(≥2species):47(1351samples)

No.ofspecies(≥2samples):297(814samples)

IdentificationratewithITS2was100%and78%at

genusandspecieslevel,respectively.XPang,ShilinChen*.Cladistics,2011,27ComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatITSshouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants

ChinaPlantBOLGroup,LiDezhuetal.,PNAS,2011WethereforeproposethatITS/ITS2shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.(建議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核心條形碼)IncaseswhereitisdifficulttoamplifyanddirectlysequenceITSinitsentirety,justusingITS2isausefulback-upasitiseasiertoamplifyandsequencethissubsetofthemarker.(ITS難以擴(kuò)增和測序時，ITS2可以有效地彌補(bǔ)該缺陷)

創(chuàng)建ITS2為主體條形碼的中草藥鑒定體系研究一萬余份藥材樣本（涉及數(shù)千個基原物種）70余篇相關(guān)文章發(fā)表于Cladistics、PLoSONE、PNAS、BMCEvolBiol、中國科學(xué)等雜志出版《中藥DNA條形碼分子鑒定》人民衛(wèi)生出版社起草中國藥典中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，已獲準(zhǔn)納入國家藥典建立中藥DNA條形碼分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)流程冬蟲夏草混偽品及近緣種人造偽品：滇紫菀冬蟲旦夏草及其性混偽喊品/近緣增種背景誼：分布竟范圍勢狹窄啞，生殲態(tài)環(huán)梳境脆符弱，前資源適蘊(yùn)藏都量有熱限（訴產(chǎn)量傍每年80競-1陡00噸）；市場點(diǎn)產(chǎn)不非足銷后，價蔽格已摩超黃哈金(G較uo障,截20胸12船)混偽攏品泛則濫，討如古蟻尼蟲呢草，覽蛹蟲登草，陸人造初偽品墳滇紫乞菀等樣品雖：冬蟲歇夏草棚與13種混卻偽品紗及近睜緣種徒，冬妻蟲夏嘗草采棒自四劇川、輪青海偽、西跟藏等鋤主產(chǎn)欺區(qū)18片5條IT叫S/館IT嚴(yán)S2序列(冬蟲眠夏草款樣品53份，關(guān)偽品45份，Ge貢nB眾an他k序列87條)A：正嘩品：冬蟲圖夏草B：偽撿品：亞香大棒蟲扎草/古尼肚蟲草C：人奴造偽糠品：滇紫舌菀D：偽碌品忙涼山戲蟲草E：偽怠品：蟬花F：偽天品：剃下垂低蟲草G：偽寺品：Co阻rd什yc列ep為s族ro織be順rt洋si信i（新合西蘭籌）結(jié)果饒：基于BL蛙AS命T/DI覽ST射AN啦CE的鑒雖定效喜率：10擊0%基于NJ央t恩re匪e的鑒糞定結(jié)畝果：泉所有堡的冬想蟲夏歐草序吉列單捕獨(dú)聚植為一誓支，并能爸與所塊有的找混偽闊品及彩近緣國種區(qū)側(cè)分開Xi烘an壇g免L,樸Ch康en濟(jì)S尋L,衫e飲t弱al膽.巡壽FE浮MS封m飄ic裂ro姜bi歐ol滴og寫y鬧le腔tt僚er凳s,禍2平01村3,嘗3耕47挪(2裝):假1贏56貝-1耕62倡.DN抹A條形足碼鑒粘定冬蟲輛夏草及其絹偽品《中國解藥典》中藥京材DN波A條形碼調(diào)分子流鑒定槽指導(dǎo)話原則Mo非rp奮ho酷lo戚gi除ca鏡l卻ch獅ar探ac膏te滴ri擋st吉ic僑s兇of垂t卵he鬧p嘩ow妻de酒r,淹d誕ec悶oc粉ti銀on種p顏ie剝ce掃s,來s鄉(xiāng)豐ee窗d嫂,s梯ee宮dl繁in舞g,需an醋d走fi自br麻e繼am鞭on遠(yuǎn)g奧th監(jiān)eP.晝gi酸ns贏en遵g,P.鉤q尺ui親nq述ue校fo傻li犬us啞,府P丑no莊to行g(shù)i富ns謎en抗gan己d丘it扯s析c立lo賽se走ly乓r起el枯at身ed寄s練pe亞ci棵es蚊a秩re層s傷im可il尊ar奧.It艙i朗s導(dǎo)di己ff金ic吵ul站t愿to蠢i煌de店nt荒if群y鉆so創(chuàng)m需an僅y是di嘴ff摘er淘en嗓t茄pa喬na電x翅sp奇ec樹ie塵s蓋an停d嫁gi再ns啄en音g致pr凡od脖uc慚e飽in清m秋ed諷ic晃in猶al室u槍se成sby軌t勻ra兵di公ti幼o(hù)n奮al崇c廈la燭ss丑if鴨ic伏at店io恢n梯me院th桌od蕉s.Us母in激g濫DN境A扒ba淋rc望od趟e它to斃i框de俱nt劉if尼y際pa究na允x平me屆di舉ci決na威l隱sp壇ec懂ie揪s人參同類及忌其混器偽品啞的鑒時定13

15101520253035404550SN越01費(fèi):p.擴(kuò)gi拜ns德en脂g;SN以03找:p.滿qu腸in跌qu歌ef雕ol合iu高s顯示輛人參室、西牲洋參IT翅S2序列浙的SN渾Ps位點(diǎn)食信息腎。Po祝si染ti摘on轎3卷2犬a(chǎn)n司d飾43為區(qū)徒別人編參和羅西洋辦參的SN康Ps位點(diǎn)為驗(yàn)衛(wèi)證該彼方法進(jìn)準(zhǔn)確各性，除我們裳下載推了Ge叔nB液an倉k所有紀(jì)人參頌、西觸洋參IT脅S2序列凝，表全明兩光個SN絕Ps位點(diǎn)哪穩(wěn)定暴存在樣品嘗來源材：采戴集了仗主產(chǎn)咐區(qū)吉會林，篩遼寧策，黑炎龍江參，北玻京，知山東,加拿鮮大及英上海秩和香總港藥調(diào)市人允參西尿洋參助樣品申共計(jì)72份應(yīng)用ITS2序列兩個SNPs可以快速準(zhǔn)確鑒別人參西洋參，所得組合為C-T，則確定為人參，所得組合為T-C，則確定為西洋參IT田S2萄s恩eq仗ue總nc竟e言po誰si局ti桶on句1圓-5緩0騙ofp.條gi經(jīng)ns妨en腥g鑰a等nd暮p.丟q剃ui范nq棍ue捧fo船li堅(jiān)us方慚法結(jié)令果結(jié)昌論基于IT甜S2條形欣碼鑒喇定人井參和牲西洋創(chuàng)參Ge阻ne既,僵20剖13固,逼53愛0(械1)藍(lán):倆39蹄-4貪3.A堂Fa授st納S憐NP偉I窄de堂nt穿if雁ic蹦at扎io原n屠of惠M血ed跟ic歲in據(jù)alPa尺na票xSp雷ec董ie冷s匠Ba你se減d澤on飼D之NA估B伍ar授co獸di皮ng鴨A威na羨ly場si代s,14金銀歪花藥材腹及其努混偽霜品的IT耕S2條形欠碼鑒砌定金銀花（忍冬）山銀花（紅腺忍冬）山銀花（黃褐毛忍冬）山銀花（灰氈毛忍冬）研究喝對象惜：包括24份金鼻銀花藥材。M:污m到ar漆ke氧r1、26察:陰性淋對照(C民K)2-攀25碗:金銀拜花27模-4舉7：混飄偽品DN龜A提?。喝〗鸹ャy花企藥材暮約25束m然g，利潮用植筑物基職因組DN術(shù)A提取粥試劑兔盒(T躲ia鞭ng撫en盯B訪io慮te齡ch冠C孝o.品,吳Ch秘in子a)提取砌總DN輝A。IT灣S2序列PC搜R擴(kuò)增叛程序精及電謎泳圖94℃變性5min94℃變性30sec58℃退火30sec72℃延伸45sec72℃延伸10min40個循環(huán)BL魯AS畜T鑒定Id桿en側(cè)ti敵fi躺ca炮ti哈on粱o膠f蚊Co礎(chǔ)rt潔ex織H爛er萬bsSu半n拐ZY鴿,基Ch附en妻S懸L*蠻.糧J趟Na醬t昆Me趁d.遵2耐01使2.Th襖e販id蹦en臂ti輝fi評ca拋ti輩on興e架ff鑰ic勇ie拖nc自y刻of豬5權(quán)1敲sa康mp膊le供s搖be時lo血ng附in亮g際to慘1霸9葛ki珠nd粗s糞ofco就rt龍ex尖h碑er狂bs魔i蠢n腐Ch徹in武es窩e蹤蝶Ph廊ar運(yùn)ma小co抓po趁ei遭aex廈am臂in請ed耐w裕as釣1喚00灶%劉us才in旦g副IT瓦S2揀s篇eq旺ue舟nc莊e宰as侍D儀NA席b例ar遇co狐de兩.Ap市pl暖y鼠th喉e搖IT詢S2左b架ar料co供de量t住o姐au比th倦en適ti夕ca殘teme甩di項(xiàng)ci夢na掛l宵ma鈴te卷ri暈al勢s皮類雅藥材犬的條束形碼榮鑒定條羌N.franchetii大頭羌N.franchetii蠶羌N.incisumPh犁yl械og避en冷et安ic馳t糞re眠e鏡co餓ns患tr吐uc塘te層d澆wi邁th掘t濱he沸I姑TS乒/I治TS愛2慕se幸qu鏈en樹ce顫sadulterantsITSITS231me會di孝ci張na逗l扎ma陸te刻ri溝al墳s劑sa詳mp饞le匆sSt亡ab流il背it俗y腦an譽(yù)d蔥Ac絮cu柔ra僵cy歌o粘f雅th介e恥Id帖en弱ti右fi施ca蹈ti位on盛u由si狠ng查IT惰S/落IT逝S2洪b秘ar互co震de裳s(N麥ot粒op猾te具ry臟gi合i進(jìn))羌活扶藥材IT中S/碗IT橫S2條形哭碼鑒性定及艙其穩(wěn)榴定性替與準(zhǔn)圣確性項(xiàng)研究Th頁e喪NJ看t辦re令es爭s城ho挨we攀d棟th軋atQi羊an鑼gh胖uoan歐d介it顆s敘ad陶ul把te沈ra述nt困s底ca基n沉be謙e嶼as郊il其y梅di越ff回er源en睬ti甚at障ed體a梢cc鈔or造di闊ng交t脫o朋th銅ei嶄rmo飯no卡ph米yl黨y..ITSITS2HaplotypeVariablesitesHaplotypeVariablesitesN.incisum4433N.franchetii61045Xi劍n旺T褲C著he置n蒙S*,爽et貴a句l.愁A(yù)轉(zhuǎn)ct菊a助Ph腥ar荷m泥Si壯n.容20趕12普,謀8Us臘e揉of科t羽he頭p帝ot伐en葉ti宗al扎D舒NA絹b蜻ar海co徐de賺I盞TS乞2臉to平i枝de流nt授if案y斥he桐rb糞al隆m駕at亦er肥ia粗ls全草規(guī)類DN止A條形找碼鑒白定Th辰e茶IT袋S2擦b侵ar辜co成de演c捉ou就ld惰d墾is酸t(yī)i挎ng嗎ui鉛sh麥s吩uc辜ce邀ss處fu賴ll筑y暑al鴿l舟th糾e烤34針h敲er醒bs仆f捷ro將m默th效ei綱r愈11慣1聾ad母ul庫te穿ra警nt乞s.Fi扶gu剪re僚1斧.猜Th糠e喘pr絕es惹en倦ce倉/a氏bs箏en達(dá)ce早o律f京ba目rc斜od腔e慢ga倚ps扇b屠et蒜we劍en境h教er叮bs倉a楊nd蘇t建he捷ir蓮a僑du粱lt遙er描an醒ts么.Pa醬ng雹X陵H,論C森h(huán)e貌n六SL營*袋e紐奉t邁al網(wǎng).臺J役Na鉛t欣Me燥d.已2扭01塞2建立造中藥雞材DN鋼A條形丈碼鑒擾定系住統(tǒng)網(wǎng)妻站DN偽A訪ba注rc父od脫e槐sy裕st杏em澤sh身ow擁s霜st猛ro霞ng攪a找bi滅li初ti摘es仁i灑n外id牢en表ti托fy貫in胳g企he由rb良c己ry舒pt遙ic閘s腳pe旅ci控esBL滿AS暴TPR擦OC宴ES剪S打開方網(wǎng)址參，進(jìn)哭入中閥藥材DN黃A條形黨碼鑒周定系膀統(tǒng)主蛙頁點(diǎn)擊遇物種弓鑒定襪，選遙擇植羞物類構(gòu)藥材艘鑒定遞（IT產(chǎn)S2麻/I命TS）進(jìn)擁入右窮圖界西面。在空蘋白處截粘貼并入需億要校股對的肝序列歡（Qu第er毫y）點(diǎn)澇擊左撥下角閑的提漢交比對盲序列約相似旨性信將息10案0.澤0%為人鞋參，說緊明該帳序列衡鑒定壞結(jié)果灰為人趟參Qu巷ic抵k-坊an攜d-爐ea蔬sy我D詢NA襪i屆de茫nt蹲if智ic辟at奶io楚n癥of抬h笛er離bs均i消s作un搬de冊r跪wa棗y華潤起三九戚中藥零材DN擴(kuò)A條形尖碼鑒安定專今用軟凝件20敬23發(fā)/6天/2窗6七葉油皂苷表注射銅劑娑據(jù)羅子狗藥材杯的基壟原植芝物為姿七葉士樹Ae書sc榴ul蒼usch爺in宏en贈si忘s、浙要江七辨葉樹Ae稼sc若ul胃usch阿in企en值si柳sva冬r.ch粉ek鑄ia害ng謝en跌si主s和天齡師栗Ae宜sc勿ul米u(yù)swi勻ls奏on腐ii娑羅味子藥末材DN裳A條形灰碼鑒凍定1.材料

七葉樹屬10個物種42份樣本采自云南、四川、陜西、湖北、浙江和北京的各個分布區(qū)域結(jié)論七葉樹屬候列擴(kuò)增效率與測序成功率均為100%，并且物種鑒定效率最高，為95.4%，更適用于七葉樹屬的鑒定分析。psbA-trnH序列的種間差異最大，在區(qū)分物種上具有優(yōu)勢。基于psbA-trnH序列構(gòu)建的NJ樹，可準(zhǔn)確鑒別其各個基原物種。七葉樹屬植物psbA-trnH序列比對變異位點(diǎn)圖正品柴胡米C仗ha宗ih墓u正品：為休傘形路科植湯物柴胡Bu緩pl嘩eu低ru賞m看ch裹in努en只seDC變.、狹葉樣柴胡B.促s執(zhí)co騾rz美on報er捉if寧ol顫iu缸mWi真ll患d.業(yè)的干銀燥根順。近緣虎種：同憲屬植駁物麗江等柴胡B.怪r燦oc委ki滿i，小葉賊黑柴愧胡B.道s驕mi禮th箱iiva速r.pa叉rv孤if裙ol蛾iu灰m，抱莖鬧柴胡B.帳l每on閥gi色ca駁ul濃eva將r.am診pl朗ex泛ic罵au倆le，細(xì)莖妥有柄拆柴胡B.濫p遍et姨io政lu遇la遣tu羞mva精r.te器ne牽ru瘡m和窄竹乎葉柴蠶胡B.供m包ar革gi苗na大tu溫mva慚r.st塔en黑op挺hy世ll惕um。（三塞）柴饅胡與謹(jǐn)其近毫緣種誘的NJ樹圖夕所示吹：柴穴胡正捉品基讀原柴夫胡與找狹葉鼓柴胡準(zhǔn)均獨(dú)繞立聚吼為一卸支，渠與其離混偽自品可傍以區(qū)董別開隱。結(jié)果北表明南：基于IT葬S2序列鼻能很劉好的絮區(qū)分勝柴胡鞭及其拼近緣蘿種（一剩）柴振胡及脅其及秋其近宋緣物侍種IT黎S2序列關(guān)的二級狀結(jié)構(gòu)：（二）蛾柴胡倍與其舊混偽期品IT嗓S2序列繞間存掘在較多港變異塔位點(diǎn)柴胡礙不同初基原IT做S2條形蛾碼co爽ns作en厚su咬s序列柴胡IT受S2序列棚峰圖常用和中藥番材進(jìn)夸行了DN由A條形揉碼研普究課題燙組已趙經(jīng)進(jìn)棋行DN刮A條形辱碼研急究的云常用順中藥塞材包俯括：酷人參產(chǎn)，西菌洋參搶，三荒七，閑大黃域，石斛錄，重速樓，甚金銀題花，里丹參河，天價南星渾，紅仿豆蔻歌，肉規(guī)蓯蓉語，京為大戟黑，麻栗黃，激高良痕姜扣，何緒首烏溜，吳回茱萸貸，連堅(jiān)翹，判甘草威，玉結(jié)竹，捷冬蟲套夏草旋，羌請活等Pu蹤蝶bl聰is今he椅d偷pa諒pe歇rs悔o吃n畝DN姨A赴ba暗rc顧od蓋eCladistics,2011,27:BMCEvol.Biol.,2010,10:324

PLoSONE,2010,5:e13102.ChinaPlantBOLGroup.PNAS,2011,108(49)FEMSMicrobiologyLetters,2013

PLoSONE,2012,7(5):e35146.JingyuanSong,ShilinChen*.PLoSONE,2012,7(8),PL便oS倡O五NE恐,究20曠10巴,5馳:赤e8舉61逼3在go君og待le令s刊ch休ol束ar中搜捏索DN共A蓬ba亦rc撿od佩e共2倉萬條前3厲篇京有使1篇是中閱國發(fā)帶表。DN嬸A軍Ba馳