霍亂弧菌實驗室檢測演示文稿

霍亂弧菌實驗室檢測演示文稿本文檔共22頁；當前第1頁；編輯于星期二\21點45分

霍亂弧菌的實驗室檢測

本文檔共22頁；當前第2頁；編輯于星期二\21點45分目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生手段:檢測人員是否有足夠的責任心?檢測試劑準備是否齊全且符合要求?是否嚴格按照檢測流程進行操作?本文檔共22頁；當前第3頁；編輯于星期二\21點45分

什么是霍亂?

霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌（V．cholerae）引起的急性腸道傳染病，發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病。霍亂概述古典生物型小川型Ogawa(AB)O1群稻葉型Inaba(AC)埃爾托生物型彥島型Hikojim(ABC)霍亂弧菌霍亂病原菌O139群（Bengal）非O1群O2-O200群腹瀉病原菌本文檔共22頁；當前第4頁；編輯于星期二\21點45分病原體

O1群，O139群霍亂弧菌發(fā)病特征：

劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水時致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達到20－50％（重癥病人達70－100％）

培養(yǎng)特性：營養(yǎng)要求不高，兼性厭氧，37℃生長，怕酸嗜堿，pH:7.4-9.6快速生長檢驗依據(jù)：

WS289-2008《霍亂診斷標準》霍亂防治手冊（1999年第五版）本文檔共22頁；當前第5頁；編輯于星期二\21點45分

霍亂的實驗室檢測

樣品的采集和運輸不同樣品的病原分離流程及技術要點

糞便

水體

水產品，食品等平板分離及可疑菌落挑取菌落鑒定常用快速檢測方法

膠體金檢測條

熒光PCR檢測檢測工作中應關注的事項

本文檔共22頁；當前第6頁；編輯于星期二\21點45分

樣品的采集和運輸采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標本：食物、水、環(huán)境類樣品……

監(jiān)測：水樣，水產品等運輸：一般要求在3小時內室溫（20-25℃）條件下送達實驗室檢測

C-B運輸培養(yǎng)基（pH8.4）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（）

：不是最佳的，尤其6小時內還不能進行培養(yǎng)時，盡量采用C-B運輸培養(yǎng)基。本文檔共22頁；當前第7頁；編輯于星期二\21點45分糞便的采集與保存運送

以采集病人自然排除的新鮮糞便為主，水樣便采取1～3mL，成形便采取指甲大小的糞量，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內3～5cm處采取，采集后的樣品應盡快挑取接種于堿性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2），同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小時內送達實驗室檢測的樣品，應插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基（或文臘二氏保存液）中送檢。標本與保存液比例約為1∶5。分離培養(yǎng)要點（兩管三板法）：

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時吸取0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時后劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第三板）。

糞便分離流程及技術要點本文檔共22頁；當前第8頁；編輯于星期二\21點45分水體的采集與保存運送

水體的采集一般用無菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內)500ml，密封加蓋后于室溫（20-25℃）3小時內送達實驗室檢測。分離培養(yǎng)要點（十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法）：

取450ml水樣，用1M氫氧化鈉調整至pH8.4-9.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50ml。再加入1%亞碲酸鉀0.25～0.5ml和1000單位/ml青霉素1ml。37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）分離培養(yǎng)，同時吸0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物轉種于堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6～8h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）。

水體分離流程及技術要點本文檔共22頁；當前第9頁；編輯于星期二\21點45分水產品的采集與保存運送

通常選取活的或者新鮮的水生動物為采集對象，有時也應考慮冰凍的水生動物，有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關處置涂抹采集：

使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔，直接接種到20ml堿性蛋白胨水作為增菌液處理。整體或局部采集：在實驗室應以無菌操作將其解剖，取鰓部和腸內容物25克剪碎后，置滅菌均質杯或均質袋中，加入225mL倍體積的堿性蛋白胨水增菌；但小貝殼類動物，則用錘子將外殼擊碎，整體放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌；甲殼類動物除含肉質部分外，其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等)整體放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌。分離培養(yǎng)（兩管兩板法）：

接種后的堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）．同時吸0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物轉種于10ml堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6～8h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）。

水產品分離流程及技術要點本文檔共22頁；當前第10頁；編輯于星期二\21點45分本文檔共22頁；當前第11頁；編輯于星期二\21點45分平板分離

選擇性分離平板應采用9cm分離平板（不建議采用7cm平板），一個平板分離一個樣品（嚴禁一個平板分離2份或以上樣品?。。?/p>

樣品平板分離時應進行分區(qū)劃線分離，平板分離的單個菌落數(shù)量應該達到50個以上?？梢删涮羧〗浀涞蔫b定步驟要求每個平板應挑取5個以上可疑菌落,轉種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面待分純培養(yǎng)后,再進行O1、O139群血清玻片凝集試驗，鑒于對霍亂疫情應急處理的考慮,現(xiàn)大多數(shù)監(jiān)測實驗室一般采用將血清玻片凝集試驗前置的做法,作為快速篩查的手段,直接對平板上生長的單個可疑菌落進行玻片凝集試驗,出現(xiàn)明顯凝集時可做初步報告,對平板上出現(xiàn)可疑凝集的菌株必須馬上轉種于克氏雙糖斜面或者普通瓊脂斜面,待純培養(yǎng)物生長良好后再次進行玻片凝集試驗加以確證。

慶大霉素平板和4號瓊脂：多呈半透明狀，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時間的延長而加深（由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成份）。

TCBS（硫代硫酸鹽枸櫞酸鹽膽鹽瓊脂）：菌落生長呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。（TCBS平板生長的菌落不能直挑取進行玻片凝集試驗，需按經典方法進行純培養(yǎng)后再進行玻片凝集試驗）

平板分離及可疑菌落挑取本文檔共22頁；當前第12頁；編輯于星期二\21點45分本文檔共22頁；當前第13頁；編輯于星期二\21點45分染色鏡檢革蘭染色陰性的短桿菌血清凝集試驗：

分別使用O1群，O139群霍亂血清進行凝集試驗，同時使用生理鹽水進行對照凝集，以排除與生理鹽水發(fā)生凝集的自凝菌。

生理鹽水不凝集，O1群血清明顯凝集的菌落，進一步使用稻葉型和小川型血清進行凝集試驗，判定型別：稻葉型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落為稻葉型，小川型血清凝集而稻葉型血清不凝集的菌落為小川型，如稻葉型血清和小川型血清均出現(xiàn)凝集的時候，要注意鑒別是否為彥島型，需進行試管凝集試驗且兩者的凝集效價均超過一半以上才能判定為彥島型，因為某些小川型菌落自身會帶有少量的C抗原而出現(xiàn)與稻葉型血清發(fā)生弱凝集，因此如小川型血清凝集較稻葉型血清凝集有明顯優(yōu)勢時應維持小川型的判定。

生理鹽水不凝集，O139群血清明顯凝集的菌落，一般為O139群，但其與O22群及O155群甚至一些非霍亂弧菌會出現(xiàn)交叉凝集，由上級實驗室進行進一步確認。

菌落鑒定本文檔共22頁；當前第14頁；編輯于星期二\21點45分O1群和O139群抗原構造與血清分型型別群特異性抗原型特異性抗原AO139BC小川+++少量稻葉+—+彥島+++O139—+——本文檔共22頁；當前第15頁；編輯于星期二\21點45分國內商品化的霍亂檢測血清國外血清：日本生研，泰國S&A血清等本文檔共22頁；當前第16頁；編輯于星期二\21點45分進一步實驗氧化酶試驗1％鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液粘絲試驗0.5％去氧膽酸鈉水溶液

本文檔共22頁；當前第17頁；編輯于星期二\21點45分生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產酸不產氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）

霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API20E鑒定條等全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2COMP全自動生化鑒定卡等進一步分型鑒定(省CDC進行)

噬菌體分型

PFGE脈沖場分型

進一步實驗本文檔共22頁；當前第18頁；編輯于星期二\21點45分針對原始樣品（如病人糞便）以及初始增菌后的菌液進行快速檢測膠體金快速檢測卡

O1群霍亂膠體金標記快診卡

O139群霍亂膠體金標記快診卡熒光PCR快速檢測試劑盒

O1群、O139群雙色熒光檢測試劑盒

霍亂CTX毒力基因熒光檢測試劑盒注：快速檢測并不能替代常規(guī)檢測的進行，只是作為輔助檢測的一種手段霍亂快速檢測技術的應用本文檔共22頁；當前第19頁；編輯于星期二\21點45分霍亂弧菌膠體金免疫層析檢測本文檔共22頁；當前第20頁；編輯于星期二\21點45分

熒光PCR檢測霍亂弧菌病例標本檢測環(huán)境和食品調查的初篩方法O1群、O139