熒光分光光度計(jì)原理

熒光分光光度計(jì)--原理2分子熒光分析法根本要點(diǎn)：根本要點(diǎn)：理解分子熒光法的根本原理；把握分子熒光放射光譜的特；了解熒光光譜儀的組成及各局部作用；把握分子熒光分析法的定量分析方法及主要應(yīng)用范圍。物質(zhì)分子或原子吸取輻射被激發(fā)后，電子以無(wú)輻射躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射的方式釋放這一局部能量而產(chǎn)生的光譜稱(chēng)為熒光、磷光。依據(jù)物質(zhì)承受的輻射能量的大小及與輻射作用的質(zhì)點(diǎn)不同，熒光分析法可分為以下幾種：X射線熒光分析法X〔10-8s〕X射線范圍內(nèi)的熒光。原子熒光分析法：待測(cè)元素的原子蒸氣吸取輻射激發(fā)后，在很短的時(shí)間內(nèi)10-8躍遷至基態(tài)，這種二次輻射即為熒光，依據(jù)其波長(zhǎng)可進(jìn)展定性，依據(jù)譜線強(qiáng)度進(jìn)展定量。熒光的波長(zhǎng)如與激發(fā)光一樣，稱(chēng)為共振熒光。熒光的波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)，稱(chēng)為stokes熒光；假設(shè)短，稱(chēng)為反stokes熒光。分子熒光分析法：有些物質(zhì)的多原子分子，在用紫外、可見(jiàn)光〔或紅外光〕照耀時(shí)，也能放射波長(zhǎng)在紫外、可見(jiàn)〔紅外〕區(qū)熒光，依據(jù)其波長(zhǎng)及強(qiáng)度可進(jìn)展定性和定量分析，這就是通常的〔分子〕熒光分析法。根本原理一.分子熒光的發(fā)生過(guò)程〔一〕分子的激發(fā)態(tài)——單線激發(fā)態(tài)和三線激發(fā)態(tài)成對(duì)自旋，方向相反，電子凈自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1M為磁量子數(shù))，因此，分子是抗〔反〕磁性的，其能級(jí)不受外界磁場(chǎng)影響而分裂，稱(chēng)“單線態(tài)”；圖1 單線基態(tài)〔、單線激發(fā)態(tài)〔〕和三線激發(fā)態(tài)〔〕當(dāng)基態(tài)分子的一個(gè)成對(duì)電子吸取光輻射后，被激發(fā)躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不轉(zhuǎn)變，即S=0 ，則激發(fā)態(tài)仍是單線態(tài)，即“單線(重)激發(fā)態(tài)”；假設(shè)電子在躍遷過(guò)程中，還伴隨著自旋方向的轉(zhuǎn)變，這時(shí)便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，電子凈自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1其多重性：M=2S+1=3即分子在磁場(chǎng)中受到影響而產(chǎn)生能級(jí)分裂，這種受激態(tài)稱(chēng)為“三線(重)激發(fā)態(tài)”；“三線激發(fā)態(tài)”“單線激發(fā)態(tài)”能量稍低。但由于電子自旋方向的轉(zhuǎn)變?cè)诠庾V學(xué)上一般是禁阻的，即躍遷幾率格外小，只相當(dāng)于單線態(tài)10-6~10-7。〔二〕分子去活化過(guò)程及熒光的發(fā)生：〔一個(gè)分子的外層電子能級(jí)包括S0〔基態(tài)〕和各激發(fā)態(tài)S1，S2，…..，T1…..，每個(gè)電子能級(jí)又包括一系列能量格外接近的振動(dòng)能級(jí)〕處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，在較短的時(shí)間內(nèi)可通過(guò)不同途徑釋放多余的能量〔輻射或非輻射躍遷〕回到激態(tài)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為“去活化過(guò)程”，這些途徑為：振動(dòng)弛豫：在溶液中，處于激發(fā)態(tài)的溶質(zhì)分子與溶劑分子間發(fā)生碰撞，把一局部能量以熱的形式快速傳遞給溶劑分子〔環(huán)境，在10-1~10-13的最低振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程稱(chēng)為振動(dòng)弛豫。圖2 分子吸取和放射過(guò)程的能級(jí)圖內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)激發(fā)態(tài)S2的較低振動(dòng)能級(jí)與S1的較高振動(dòng)能級(jí)的能量相當(dāng)或重疊時(shí)，分子有可能從S2的振動(dòng)能級(jí)以無(wú)輻射方式過(guò)渡到S1無(wú)輻射過(guò)程稱(chēng)為“內(nèi)轉(zhuǎn)換”。〔“內(nèi)轉(zhuǎn)換”過(guò)程同樣也發(fā)生在三線激發(fā)態(tài)的電子能級(jí)間〕外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用〔如碰撞〕而以非輻射形式轉(zhuǎn)移掉能量回到基態(tài)的過(guò)程稱(chēng)“外轉(zhuǎn)換”。疊時(shí)，發(fā)生電子自旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變的S—T躍遷，這一過(guò)程稱(chēng)為“系間跨躍”?！埠懈咴有驍?shù)的原子如Br2、I2的分子中，由于分子軌道相互作用大，此過(guò)〕熒光放射：當(dāng)激發(fā)態(tài)的分子通過(guò)振動(dòng)馳豫—內(nèi)轉(zhuǎn)換—振動(dòng)馳豫到達(dá)第一單線激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)時(shí)，第一單線激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子可通過(guò)放射輻射〔光子〕躍回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)，此過(guò)程稱(chēng)為“熒光放射”。假設(shè)熒光幾率較高，則放射過(guò)程較快，需10-8〔它代表熒光的壽命〕〔S〔簡(jiǎn)潔在10-11~1013秒內(nèi)完成，所以通過(guò)重疊的振動(dòng)能級(jí)發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的幾率要比由高激發(fā)態(tài)發(fā)射熒光的幾率大的多，因此，盡管使分子激發(fā)的波長(zhǎng)有短〔〕有長(zhǎng)〔2熒光的波長(zhǎng)只有〔1。磷光放射：第一電子三線激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子以放射輻射〔光子〕的形式回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)，此過(guò)程稱(chēng)為“磷光放射”?！擦坠獾牟ㄩL(zhǎng)4較熒光的波長(zhǎng)3稍長(zhǎng)，發(fā)生過(guò)程較慢約10-4~10s〕由于三線態(tài)—〔1-3~10s左右假設(shè)沒(méi)其它過(guò)程同它競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，磷光的發(fā)生就有可能；由于三線態(tài)壽命較長(zhǎng)，因而發(fā)生振動(dòng)弛豫及外轉(zhuǎn)換的幾率也高，失去激發(fā)能的可能性大，以致在室溫條件下很難觀看到溶液中的磷光現(xiàn)象。因此，試樣承受液氮冷凍降低其它去活化才能觀看到某些分子的磷光。總之：處于激發(fā)態(tài)的分子，可以通過(guò)上述不同途徑回到基態(tài)，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優(yōu)先發(fā)生。假設(shè)—放射熒光使受激分子去活化過(guò)程與其他過(guò)程相比 高，強(qiáng)度大。假設(shè)—放射熒光使受激分子去活化過(guò)程與其他過(guò)程相比 發(fā)生。〔三〕熒光量子效率：物質(zhì)放射熒光的光子數(shù)與吸取激發(fā)光的光子數(shù)的比值。 放射熒光的光子數(shù) (1)吸取激發(fā)光的光子數(shù)0~1之間。他的大小取決于物質(zhì)分子的化學(xué)構(gòu)造及環(huán)境〔t0c、pH、溶劑等。二.激發(fā)光譜與熒光〔放射〕光譜激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)轉(zhuǎn)變激發(fā)光波長(zhǎng)，固定熒光放射FF從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長(zhǎng)ex選用ex可得到強(qiáng)度最大，的熒光。熒光光譜：選擇ex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)放射的熒光分光，記錄每一波長(zhǎng)下的F，作F-光譜圖稱(chēng)為熒光光譜。em。ex與em一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長(zhǎng)。三.熒光與分子構(gòu)造的關(guān)系分子構(gòu)造與熒光具有及n電子共軛構(gòu)造的分子能吸取紫外和可見(jiàn)輻射而發(fā)生-*或n-*躍遷，然后在受激分子的去活化過(guò)程中發(fā)生*-或*-n躍遷而放射熒光。發(fā)生-*躍遷分子，其摩爾吸光系數(shù)〔?〕比n-*100—1000倍，它的激發(fā)單線態(tài)與三線態(tài)間的能量差異比n-*的大的多，電子不易形成自旋反轉(zhuǎn)，體系間跨越幾率很小，因此，-*躍遷的分子，發(fā)生熒光的量子效率高，速率常數(shù)大，熒光也強(qiáng)。所以——只有那些具有共軛雙鍵的分子才能放射較強(qiáng)的熒光；電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度就越大〔ex與em長(zhǎng)移〕大多數(shù)含芳香環(huán)、雜環(huán)的化合物能發(fā)出熒光，且電子共軛越長(zhǎng)，越大。取代基對(duì)分子放射熒光的影響〔1〔苯環(huán)上取代共軛程度上升–CH–N2，–OH，–OR等。(苯環(huán)上–COOH，–CHO，–NO2，–N=N–。Br，I。共面性高的剛性多環(huán)不飽和結(jié)高的分子有利于熒光的放射。例如：熒光素呈平面構(gòu)型，其構(gòu)造具有剛性，它是強(qiáng)熒光物質(zhì)；而酚酞分子由于不易保持平面構(gòu)造，故而不是熒光物質(zhì)。溶液的熒光強(qiáng)度一.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系F和溶液吸取光能的程度以及物質(zhì)的熒光頻率有關(guān)：0F∝〔I0-It〕→F=K’〔I-It〕 (2)0K’為常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的量子效率L—B定律：IIt 10bc0

I I6t

10bc100所以 (I0-I010-bc)=K’I0(1-10-bc) =K’I(1-e-2.303bc) (3)0e-2.303bc開(kāi)放，得FK”I

(2.303bc

(2.303bc)2

(2.303bc)3

) (4)0 2! 3!2.303bC0.05時(shí)(濃度很小，溶液較稀時(shí))，上式括號(hào)內(nèi)第一項(xiàng)以后的各項(xiàng)均可無(wú)視不計(jì)，所以：

F=K’I02.303bc 〔5〕0對(duì)于一熒光物質(zhì)的稀溶液，當(dāng)I 及b肯定時(shí)，0F=K·c 〔6〕即在低濃度〔2.303bc0.05〕時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈〔線性〕正比關(guān)系。二.定量分析方法工作曲線法：0 x s 0 x 配制一系列濃度梯度的待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同空白溶液，使樣經(jīng)過(guò)一樣的處理之后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度：Fs、F、F，然后作〔F-F〕—c曲線，依據(jù)〔F–F)，從工作曲線上求得待測(cè)物的濃度〔或含量0 x s 0 x 直接比較法：假設(shè)熒光物質(zhì)溶液的工作曲線通過(guò)原點(diǎn)，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進(jìn)行測(cè)定：F FF F=Kc

F F=Kc

c x

〔7〕sˉ 0

S， xˉ 0 x

x FF s 0三.影響熒光強(qiáng)度的外界因素激發(fā)光源：一般選用ex最大但對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量承受長(zhǎng)波長(zhǎng)，低I0及短時(shí)間光照溫度：大多數(shù)分子在溫度上升時(shí)，分子與分子之間，分子與溶劑分子之間的碰撞頻率上升，非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程上升，降低，因此，降低溫度，有利于提高。pHpH值有關(guān)，有些化合物在離子狀態(tài)時(shí)不顯熒光。為此，在用熒光強(qiáng)度進(jìn)展定量測(cè)定時(shí)，嚴(yán)pH值是格外重要的。溶劑：對(duì)π—π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，?E減小↓→躍遷幾率上升↑↑〔波長(zhǎng)長(zhǎng)移〕溶劑粘度↓→↓內(nèi)濾：當(dāng)熒光波長(zhǎng)與熒光物質(zhì)或其它物質(zhì)的吸取峰相重疊時(shí)，將發(fā)生自吸取使熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度下降，此現(xiàn)象稱(chēng)“內(nèi)濾”。散射光的影響〔溶劑的二種散射〕瑞利散射光：物質(zhì)〔溶劑或其它分子〕分子吸取光能后，躍遷到基態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)，在極短時(shí)間〔10-12s〕返回到原來(lái)的振動(dòng)能級(jí)并發(fā)出和原來(lái)吸取光一樣波長(zhǎng)的光，這種光稱(chēng)為瑞利散射光。拉曼散射光：物質(zhì)分子吸取光能后，假設(shè)電子返回到比原來(lái)能極稍高〔或稍低〕的振動(dòng)能級(jí)而放射的光稱(chēng)為拉曼散射光。瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)一樣，拉曼散射與激發(fā)光波長(zhǎng)不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，因此可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)將拉曼散射光與熒光分開(kāi)。熒光熄滅劑的影響：熒光熄滅：熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如：X-，重金屬離子、O2 、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎全部的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)O2。外表活性劑的影響：提高熒光強(qiáng)度。測(cè)量熒光的儀器熒光計(jì)、熒光分光光度計(jì)的根本組成部件：激發(fā)光源、樣品池、單色器、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)。激發(fā)光源：要比吸取法中光源強(qiáng)度大。汞燈：供給線光譜〔光源強(qiáng)度隨變化大〕碘鎢燈：供給連續(xù)光譜300~700nm.氙燈：供給連續(xù)光譜250~700nm，300~400nm段強(qiáng)度相近。激光：發(fā)光強(qiáng)度大，能極大地提高熒光分析的靈敏度。樣品池：通常用石英材料制成長(zhǎng)方體形〔方形〔散射光較少一樣品池外套一個(gè)液氮的透亮石英真空瓶。單色器：熒光計(jì)——兩個(gè)濾光片。第一濾光片：在光源與樣品池之間，濾去不需要的光讓需要的激發(fā)光通過(guò)。其次濾光片：在樣品池與檢測(cè)器之間，濾去溶劑散射光，容器外表散射光，雜質(zhì)發(fā)出的光等，讓待測(cè)物質(zhì)放射的熒光通過(guò)。熒光分光光度計(jì)——兩個(gè)光柵〔位置同濾光片〕單色性好。檢測(cè)器：因熒光通常較弱，承受光電倍增管作檢測(cè)器，靈敏度高。顯示系統(tǒng)：光度表、計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)等應(yīng)用與例如一.無(wú)機(jī)化合物的熒光分析無(wú)機(jī)化合物除了鈉鹽等少數(shù)例外，一般不顯示熒光。但很多金屬或非金屬離子可以與一有電子共軛構(gòu)造的有機(jī)化合物形成有熒光的化合物后，用熒光法測(cè)定：直接分析法：形成配〔鰲〕合物元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sn、Si、Ta(鉭)、Th(釷)、Te、W、Zn、Zr等。常用有機(jī)熒光試劑：8-羥基喹啉，安眠香、茜素紫醬R，黃酮醇，二苯乙醇酮等。二.有機(jī)化合物的熒光分析熒光分析法主要應(yīng)用于有機(jī)物、生化物質(zhì)、藥物的測(cè)定〔200多種有機(jī)化合物如：多環(huán)胺類(lèi)、萘酚類(lèi)、吲哚類(lèi)、多環(huán)芳烴、氨基酸、蛋白質(zhì)等。藥物如：?jiǎn)岱取⑧?lèi)、異喹啉類(lèi)、麥角堿、麻黃堿等。維生素如：維生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、葉酸等。甾體、抗生素、酶、輔酶等。