ABCG2在肺癌中表達(dá)的定量研究

ABCG2在肺癌中表達(dá)的定量研究

【摘要】目的觀察ABCG2在肺癌和癌周肺組織的表達(dá)，從量化角度闡明其在肺癌組織中表達(dá)的病理學(xué)意義。方法常規(guī)石蠟包埋、HE切片確診，用免疫組化SP法檢測(cè)ABCG2在肺癌和癌周肺組織的定位和表達(dá)，用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)對(duì)其表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，并用表達(dá)的陽(yáng)性單位反映其表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果ABCG2蛋白在肺癌和癌周正常肺組織中的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。在癌周正常肺組織的支氣管和細(xì)支氣管上皮呈彌漫表達(dá)，腺上皮呈灶性表達(dá)；肺鱗癌和肺腺癌彌漫或大片表達(dá)，肺鱗癌表達(dá)的PU值高于肺腺癌()，肺大細(xì)胞癌和肺小細(xì)胞癌不表達(dá)，PU值接近于零。癌周肺組織表達(dá)的PU值高于各型肺癌。ABCG2蛋白表達(dá)的PU值在肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間無(wú)差別，且與肺癌患者的性別、年齡、轉(zhuǎn)移和TNM分期未見(jiàn)明顯相關(guān)性，與肺癌分化程度有關(guān)。分化程度越高，PU值越高，但高分化肺癌和癌周肺組織的表達(dá)PU值差異無(wú)顯著性。結(jié)論ABCG2蛋白表達(dá)程度與肺癌類型及分化程度具有相關(guān)性，可能成為判斷其指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】肺癌;ABCG2/BCRP/MXR/ABCP;免疫組化;定量分析

Abstract:ObjectiveToobservetheexpressionsofABCG2inlungcarcinomaandthenormallungtissuearounditandtoclarifythesignificanceinlungcarcinogenesis.MethodsABCG2proteinexpressionwasdetectedbyimmunohistochemistry(SPmethod)usingthemonoclonalantibodyanditsintensitywasassessedQuantitativebyLeicaQ500MCimageanalysissystem.ResultsThemonoclonalantibodyshowsspecificplasmamembranestaining,diffuselyonlungcarcinomacellsandbronchialepithelialcells,andinterspersedlyonglandularepithelialcells.ProminentstainingwasobservedinsquamouscellcarcinomaandadenocarcinomaoflungandtheirABCG2positiveunits(PU)havethesignificantdifference，anditsdifferencewasnotsignificantbetweentheprimarycarcinomaandthemetastaticcarcinoma.ABCG2PUwasnotinvolvedinthepatientssex,age,tumorsmetastasisandstaging.,andcorrelatedwiththedifferentiation.ItsPUwasdecreasingwiththehistologicalgrading.ButthePUdifferencewasnotsignificantbetweenthenormallungtissueandthewelldifferentiatedcarcinaoma.ConclusionABCG2proteinexpressionwasinvolvedinthelungcarcinogenesisanditsdifferentiationandmighthelptodistinguishcancerfromnormaltissueandtoascertainthehistologicalgrading.

Keywords:lungcarcinoma；ABCG2/BCRP/MXR/ABCP；immunohistochemistry；quantitativeanalysisABCG2屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一，可通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能將化療藥物泵出細(xì)胞導(dǎo)致化療耐藥的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)在各種來(lái)源的干細(xì)胞中ABCG2均高表達(dá)，認(rèn)為ABCG2是干細(xì)胞標(biāo)記之一［1］。目前國(guó)內(nèi)外的研究多從定性或定量不定位的角度觀察到ABCG2僅在少量正常組織、白血病和包括肺癌在內(nèi)的一些實(shí)體瘤中表達(dá)［2,3］，ABCG2在肺癌組織中的原位量化表達(dá)特點(diǎn)、變化規(guī)律及意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)原位檢測(cè)ABCG2蛋白的表達(dá)從定量角度揭示其在肺癌中的表達(dá)特點(diǎn)，闡明其與肺癌類型、分化程度、轉(zhuǎn)移和分期的關(guān)系，探索其在肺癌中表達(dá)的意義。

1材料與方法

材料收集南方醫(yī)院病理科2005年1月～2006年7月病史資料完整的原發(fā)性肺癌手術(shù)切除標(biāo)本(術(shù)前未經(jīng)治療)86例。其中男性69例，女性17例；患者最小年齡32歲，最大82歲，平均年齡61歲。所有標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。根據(jù)1999年WHO/IASLC肺和胸膜腫瘤的組織分型，將肺癌分為：腺癌，31例，其中高分化20例，中分化8例，低分化3例；鱗癌，42例，其中高分化5例，中分化11例，低分化26例；大細(xì)胞癌，5例；小細(xì)胞癌8例。肺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，肺癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例。根據(jù)美國(guó)癌癥研究聯(lián)合會(huì)AJCC癌癥分期手冊(cè)進(jìn)行臨床病理TNM分期，其中TNMⅠ期50例，Ⅱ期21例，Ⅲ期15例。同時(shí)取33例癌周正常肺組織做為正常對(duì)照。

免疫組化染色

免疫組化采用SP法。SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。一抗為鼠抗人BCRP單克隆抗體(克隆號(hào)BXP21)，德國(guó)merk公司產(chǎn)品，工作濃度1∶50。用乳腺組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。主要步驟石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，1mmol/L、檸檬酸鹽緩沖液微波95℃20分鐘，阻斷、封閉后，滴加一抗4℃過(guò)夜；次日依次加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗和StreptavidinPeraxidase，DAB顯色；不復(fù)染，脫水、透明、封固，蘇木素復(fù)染。

顯微圖像定量分析

根據(jù)空白和陽(yáng)性對(duì)照的顯色情況，在確定無(wú)假陽(yáng)性和假陰性的前提下，以細(xì)胞漿和細(xì)胞膜染成棕黃或棕褐色為陽(yáng)性。用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)，在40倍物鏡下，每個(gè)樣本隨機(jī)選取10個(gè)視野。對(duì)于正常肺，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)試20個(gè)陽(yáng)性支氣管上皮細(xì)胞或腺上皮細(xì)胞；對(duì)于肺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)試20個(gè)陽(yáng)性癌細(xì)胞。每例樣本共測(cè)試200個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，用交互式測(cè)試方法測(cè)試每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值為Gβ，同時(shí)在相應(yīng)的10個(gè)視野中測(cè)試背景灰度值并取其平均值Gα，按下式計(jì)算每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性單位值，本圖像分析系統(tǒng)中的Gmax為256。取每個(gè)樣本中200個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞值的均值作為此樣本表達(dá)的陽(yáng)性單位值［4～6］。PU值越大，表達(dá)強(qiáng)度越高；反之，表達(dá)強(qiáng)度越低。PU=|Gα-Gβ|Gmax×統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用兩樣本t檢驗(yàn)和方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以表示差異具有顯著性,表示具有非常顯著性。結(jié)果部分各表中所列平均值的誤差為標(biāo)準(zhǔn)誤(s).

2結(jié)果

ABCG2在癌周正常肺組織和不同組織類型肺癌中的表達(dá)ABCG2在癌周正常肺組織中表達(dá)的細(xì)胞定位

癌周肺組織中ABCG2基因編碼的蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色、彌散分布。主要表達(dá)在支氣管和細(xì)支氣管上皮以及部分漿液腺和黏液腺腺上皮，其中以黏液腺表達(dá)更為明顯；陽(yáng)性部位主要在細(xì)胞近腔面或基底部；支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)呈彌漫陽(yáng)性，漿液或黏液腺上皮細(xì)胞呈散在、灶性。癌周正常肺組織的肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞偶見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

ABCG2在不同組織類型肺癌中的表達(dá)

肺癌組織中ABCG2基因編碼的蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色、彌散分布。ABCG2蛋白表達(dá)的PU值在肺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞間總體比較的差異具有極為顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中肺鱗癌和腺癌與各組比較差異均有顯著性。肺鱗癌和肺腺癌普遍表達(dá)ABCG2蛋白，呈彌漫或大片分布，但表達(dá)程度不同，肺腺癌表達(dá)的PU值明顯高于肺鱗癌。肺大細(xì)胞癌和肺小細(xì)胞癌不表達(dá)，PU值接近于零，兩者之間比較差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表1。表1ABCG2在癌周肺組織和不同類型肺癌中的表達(dá)

ABCG2在癌周正常肺組織和不同組織類型肺癌中表達(dá)的比較

癌周肺組織與各型肺癌相比，ABCG2蛋白表達(dá)的PU值分別高于肺鱗癌、肺腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌，差異均有顯著性，見(jiàn)表1。ABCG2在不同組織類型肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)ABCG2在不同組織類型肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)特點(diǎn)與原發(fā)灶中的表達(dá)類似。各型肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶A(yù)BCG2蛋白表達(dá)的PU值總體比較差異有顯著性，其中肺鱗癌和腺癌與各組比較差異均有顯著性，大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌之間比較差異無(wú)顯著性；ABCG2在肺鱗癌和肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中呈陽(yáng)性表達(dá)，亦呈彌漫或大片分布，但表達(dá)程度不同，在肺腺癌轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)PU值高于肺鱗癌。肺大細(xì)胞癌和肺小細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ABCG2不表達(dá)，PU值均接近于零，見(jiàn)表2。

ABCG2在不同組織類型肺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的比較肺癌原發(fā)灶與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶相比，ABCG2蛋白表達(dá)的PU值差異無(wú)顯著性。各型肺癌原發(fā)灶與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶A(yù)BCG2蛋白表達(dá)的達(dá)PU值相比，差異亦無(wú)顯著性，見(jiàn)表2。表2ABCG2在肺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)注：上標(biāo)分別表示與其所在組比較差異有顯著性，P＜。

ABCG2蛋白表達(dá)與肺癌患者性別、年齡和癌的分化程度、轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系A(chǔ)BCG2蛋白表達(dá)的PU值與肺癌患者的性別、年齡、轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)關(guān)，與肺癌分化程度有關(guān)，見(jiàn)表3。分化程度越高，ABCG2蛋白表達(dá)PU值越高；分化程度越低，ABCG2蛋白表達(dá)PU值越低，差異具有顯著性；大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌屬于低分化和未分化癌，PU值接近于零。癌周正常肺組織ABCG2蛋白表達(dá)的PU值與高分化肺癌相比無(wú)顯著性差異，而與中、低分化肺癌的差異有顯著性。表3ABCG2蛋白表達(dá)的PU值與性別、年齡和分化、轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系

3討論

ABCG2基因是Doyle等［7］1998年首先從耐藥的乳腺癌細(xì)胞中克隆出來(lái)并引起耐藥的基因，故其編碼的蛋白又叫乳腺癌耐藥蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP）。相繼其他研究小組克隆BCRP的cDNA分別命名為MXR(mitoxantroneresistanceprotein)和ABCP(placentalABCprotein)?；谒鼈兘Y(jié)構(gòu)和序列的相似性，又屬于ABCG基因家族，人類基因組命名委員會(huì)將其統(tǒng)一命名為ABCG2。因此本文統(tǒng)一使用ABCG2。

目前研究表明ABCG2在正常組織中高表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的頂漿面、小腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞的腸腔面、肝細(xì)胞膜膽小管面、乳腺導(dǎo)管和小葉以及腦和前列腺。在肺組織中呈低水平特異性表達(dá)，主要表達(dá)在支氣管粘膜上皮層、漿液腺及毛細(xì)血管內(nèi)皮［2,8］。我們觀察了距肺癌組織5cm的周圍正常肺組織中ABCG2的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)其在支氣管上皮和部分漿液腺上皮表達(dá)，不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)ABCG2在粘液腺上皮也可以觀察到明顯的陽(yáng)性表達(dá)，但在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)明確表達(dá)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞偶表達(dá)。Jonker等［9］發(fā)現(xiàn)ABCG2基因敲除小鼠的腸道吸收譜受到明顯限制，并且影響到肝膽清除率和胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)。因此認(rèn)為ABCG2在以上正常組織的表達(dá)定位與其本身作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白影響腸粘膜的吸收率或藥物的生物利用率，肝腎和血漿的清除率有關(guān)，它可以泵出細(xì)胞內(nèi)毒物，保護(hù)組織免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)ABCG2主要表達(dá)在細(xì)胞的近腔面，提示ABCG2在正常肺組織中的表達(dá)可能與保護(hù)支氣管上皮或腺上皮免受外來(lái)刺激損害有關(guān)。

研究表明ABCG2在各種組織源性的腫瘤中廣泛表達(dá)，并無(wú)組織特異性［10］。Diestra等［3］用單克隆抗體BXP21定性檢測(cè)150例包括21種類型腫瘤在內(nèi)的未治療的實(shí)體瘤，發(fā)現(xiàn)ABCG2常表達(dá)于胃腸道、子宮內(nèi)膜和肺的腺癌以及黑色素瘤等化療耐藥的腫瘤。本研究應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)試ABCG2蛋白免疫組化顯色反應(yīng)的陽(yáng)性強(qiáng)度，定量反映ABCG2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果表明ABCG2蛋白在肺鱗癌和肺腺癌彌漫表達(dá)，肺鱗癌表達(dá)PU值高于肺腺癌。本研究組在甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子與肺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，TTF1蛋白表達(dá)的PU值在正常成人肺明顯高于各種類型肺癌［11］。這意味著正常肺組織在癌變過(guò)程中會(huì)逐漸失去ABCG2或使其表達(dá)受到抑制，而這些標(biāo)志物含量可能作為臨床判斷肺癌與正常的一個(gè)指標(biāo)。曾愛(ài)華等［12］采用RTPCR半定量檢測(cè)到乳腺癌組織中的ABCG2表達(dá)要高于癌周組織，與本研究結(jié)果相反。我們認(rèn)為RTPCR等分子生物學(xué)方法檢測(cè)過(guò)程中提取到的是整個(gè)組織的RNA或蛋白，無(wú)法從原位定位方面準(zhǔn)確反映腫瘤或正常組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)情況，我們通過(guò)免疫組化原位定量獲得目的細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)值，從原位實(shí)際地反映出細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)強(qiáng)度。

ABCG2最早是作為耐藥蛋白從腫瘤細(xì)胞中分離出來(lái)的，因此ABCG2與肺癌耐藥的關(guān)系備受關(guān)注。長(zhǎng)期的臨床工作實(shí)踐提示“高、中分化肺癌對(duì)化療耐藥，低分化及未分化肺癌對(duì)化療敏感”。YohK等［13］的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，ABCG2陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌患者化療有效率低于ABCG2陰性患者病例。我們的分析發(fā)現(xiàn)，肺癌中ABCG2蛋白表達(dá)地PU值與肺癌分化程度有關(guān)，隨著肺癌分化程度的降低ABCG2表達(dá)的PU值逐漸減弱，低分化腺癌和低分化鱗癌呈不表達(dá)或極弱表達(dá)狀態(tài)。大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌均不表達(dá)，PU值接近于零。因此根據(jù)YohK的臨床治療結(jié)果和我們的病理學(xué)研究結(jié)果，我們認(rèn)為ABCG2蛋白在肺癌中的表達(dá)一方面可以作為判斷腫瘤分化程度的指標(biāo)，另一方面也可能成為預(yù)測(cè)化療效果的指標(biāo)之一。筆者還注意到ABCG2蛋白與肺癌患者性別、年齡及癌的轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)明顯相關(guān)性，各型肺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶A(yù)BCG2蛋白表達(dá)PU值比較，差異也無(wú)顯著性，這進(jìn)一步突顯了ABCG2的表達(dá)與肺癌分化的關(guān)系。

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