蛋白多肽類藥物的藥物代謝動力學

第8章蛋白多肽類藥物的

藥物代謝動力學

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蛋白多肽類藥物的藥代動力學十分復雜，這類藥物是生物大分子,與傳統(tǒng)的化學合成藥物小分子在理化性質和體內過程等方面均有顯著不同，其藥動學特點和規(guī)律亟待闡明。該類藥物的動力學研究不僅要解決相關理論問題，而且要求發(fā)展和應用新技術、新方法和建立新體系。2

第1節(jié)蛋白多肽類藥物的體內過程

蛋白多肽類藥物的體內過程相當復雜?；瘜W結構特殊，其生理活性和體內過程不僅與其一級結構，而且與其二級和三級結構有關，作用強，用藥劑量小，生物體內存在大量相似物質的干擾，在體內經受廣泛的蛋白降解作用以及血液中存在多種不同類型的結合蛋白，如抗體、受體、受體拮抗劑等3

一、蛋白多肽類藥物的吸收和生物利用度

蛋白多肽類藥物的吸收呈現(xiàn)明顯的給藥途徑依賴性。

(一)口服吸收

多種屏障作用導致口服生物利用度很低，以致絕大多數(shù)蛋白多肽類藥物口服后不能產生足夠的有效血藥濃度。這些屏障包括：●吸收屏障分子量大極性較強具有較低的分配系數(shù)和擴散性能使其不易為親脂性生物膜攝取，故很難通過胃腸道吸收?！袼崞琳?/p>

該類藥物對胃液的強酸性（pH1~2）敏感，易被胃酸分解破壞。4

●酶屏障胃腸道存在大量的酶，如胰絲氨酸蛋白酶中的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及彈性蛋白酶以及胃液中的胃蛋白酶都對蛋白分子產生消化降解作用。多數(shù)蛋白多肽類藥物口服生物利用度很差，通常僅為2~3%，從而絕大多數(shù)這類藥物不能采用口服途徑給藥。僅極少數(shù)肽類可供口服給藥，如環(huán)孢素，由于其獨特的分子結構（環(huán)狀十一肽）使其成為高度脂溶性并對酶相對穩(wěn)定，通常制成油溶液供口服用，即使如此，其口服生物利用度亦差，且高度可變（從2%至92%），多種生理因素可影響其胃腸吸收。已知，肽類化合物中二肽和三肽尚可借助于主動機制通過腸黏膜吸收，但這種轉運方式顯示有明顯的立體選擇性，含D-型氨基酸的肽類通常吸收差，如氨基末端的氮原子或肽鍵甲基化或羧基末端轉變?yōu)轷０方Y構，則吸收進一步減少。5

(二)皮下注射

該類藥物皮下注射給藥可避免體循環(huán)前的首關效應，吸收明顯好于口服給藥，但由于蛋白酶的普遍存在，這類藥物也可部分受到皮下注射組織存在的蛋白酶的代謝破壞，致其生物利用度亦不理想如重組細胞因子皮下注射通常生物利用度低于70%。6

(三)鼻腔給藥鼻吸收遠大于口服途徑：●鼻黏膜上皮存在眾多微絨毛而具有較大的表面積●鼻黏膜具有廣泛的血管網而成為親脂性和親水性藥物的較好的吸收部位，同時給予吸收促進劑可使肽類藥物鼻吸收遠大于口服途徑。這些肽類包括▲黃體激素-釋放激素（LH-RH），▲丙氨酸-賴氨酸-促腎上腺皮質激素（Ala1-Lys17-ACTH），▲膽囊收縮素八肽，▲-硫代苯基青霉素以及頭孢菌素類等，▲胰島素在大鼠的鼻吸收達30%，且吸收迅速，由于這一點，鼻吸收途徑引起了人們的很大興趣。7

●避免了肝臟的首關效應，●擬首關效應（pseudo-firstpasseffect）。鼻上皮的嗅覺區(qū)內的細胞色素P450活性甚至高于肝臟，主要由于NADPH-細胞色素P450還原酶含量較高（約高3~4倍），已發(fā)現(xiàn)在鼻黏膜中也存在肝臟中的三類可誘導的細胞色素P450同工酶，在鼻上皮中也發(fā)現(xiàn)第Ⅱ相結合反應活性?！癖乔唤o予的多肽類藥物的生物利用度與其分子量顯著相關[3]，▲對于分子量小于10kDa的分子不需加入生物黏附劑和促進劑，?？僧a生足夠量的藥物進入體循環(huán)，生物利用度在1~10%左右?！^大分子，例如干擾素，人生長激素等即使使用生物黏附性給藥系統(tǒng)，其較大的分子亦阻礙藥物的有效吸收。肽類藥物的吸收能夠通過應用酶抑制劑而改善，某些表面活性劑如膽鹽可使蛋白變性而抑制蛋白水解酶，從而增加蛋白多肽藥物的吸收。在鼻黏膜中主要的酶類有▲氨基肽酶、▲肽鏈端解酶▲肽鏈內切酶。8

氨基肽酶酶抑制劑:阿嗎他定（amastatin）貝他定（bestatin）如鼻內單獨給予lmg/kg人生長激素（rGH）溶液后的平均血藥濃度顯著低于rGH與以下2種氨基肽酶抑制劑的聯(lián)合：0.015%阿嗎他定（amastatin）以及0.015%貝他定（bestatin）。表面活性劑:羥乙酸鈉（sodiumglycolate）與促腎上腺皮質激素-釋放激素（CRH）同用可使后者的鼻內給藥生物利用度達100%。但表面活性劑的促滲效果因不同藥物而異，如同樣的羥乙酸鈉對生長激素釋放激素GHRH的促滲作用較弱，鼻內給予（GHRH）的生物利用度僅為7.1%。9

鼻腔途徑目前已成為肽類藥物靜脈外給藥的頗受重視的重要給藥途徑，不少這類藥物已制成噴鼻劑或滴鼻劑用于臨床實踐。最早被采用的肽類藥物為垂體激素，如催產素、加壓素及其類似物，其中去氨加壓素由于鼻腔吸收良好，不良反應少，已成為尿崩癥治療的首選給藥方法。醋酸布舍瑞林(LH-RH類似物)

已有鼻內噴霧劑商品，其鼻腔給藥是僅次于注射的有效給藥方式。胰島素鼻用制劑已在美國有商品出售。10

表8-1某些蛋白多肽類藥物鼻腔給藥的吸收藥物相對生物利用度*達峰時間

h氨基酸殘基數(shù)目實驗對象胰島素1~305~1051大鼠、狗、人

生長激素釋放因子2~2020~4040~44大鼠、狗、人

胰高血糖素70~905~1029人

LH-RH激動劑和拮抗劑2~510~309~10猴、人

加壓素類似物6~1210~209人

催產素30~405~109人

腦啡肽類似物70~905~105大鼠、人

促甲狀腺釋放激素10~205~153大鼠、人

*相對于靜脈、肌肉和皮下給藥

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(四)透皮吸收

透皮吸收已成為令人注目的給藥途徑，可避免腸道和肝臟對藥物的首關效應，并可提供較好的傳輸控制和維持藥物治療水平于較長時間。通常認為皮膚的蛋白水解酶活性較低.12

影響蛋白多肽類藥物透皮吸收因素主要來自吸收屏障:▲較大的分子量▲荷電性使這類藥物很難通過被動轉運吸收，為克服這種屏障作用，通常采用離子電滲療法，如LH-RH（一種十肽）分子量1182D，在pH6.0時荷正電，可用這種方法通過皮膚吸收?！裨鰪婋念愃幬锏耐钙の?▲透皮吸收促進劑、▲pH調節(jié)▲蛋白水解酶抑制劑。13

(五)其他途徑

陰道內和肺內給予LH-RH類似物吸收程度達40~95%，胰島素達57%。直腸給予四胃泌素（Tetragastrin）生物利用度達16%，胰島素達28%。14

二、蛋白多肽類藥物的體內代謝影響這類藥物體內命運的一個最重大因素是它們給藥后在體內經受廣泛的酶介導的代謝分解，通常導致生物活性的喪失。(1)肝臟、腸道以及其他器官組織均存在大量代謝蛋白多肽的酶，就其反應類型可涉及第I相和第II相代謝反應。(2)靜脈注射給藥時這類藥物的代謝失活主要發(fā)生在肝臟，當口服給藥時則主要發(fā)生在腸道，造成顯著的腸道體循環(huán)前消除。(3)細胞色素P450與蛋白多肽類藥物的代謝關系密切，如環(huán)孢素（環(huán)狀十一肽）的代謝是細胞色素P4503A4介導的，其生物轉化包括其分子上不同部位的單羥基化和雙羥基化以及N-脫甲基反應。(4)酶抑制劑紅霉素、維拉帕米、尼卡地平、酮康唑及依曲康唑可使環(huán)孢素血濃度升高，而酶誘導劑如利福平、苯妥英以及苯巴比妥能夠降低環(huán)孢素的血藥濃度。15

(一)肝臟對蛋白多肽類藥物的代謝

●肝臟對鏈長小于8個氨基酸的小肽具有高度的攝取●這種攝取呈現(xiàn)結構特異性●被攝取的多肽可以完整形式或代謝物形式排入膽汁中肝臟對多肽的攝取機制涉及以下兩個過程：●被動轉運:疏水性肽類●主動轉運過程:低疏水性肽類；▲內吞▲載體介導多數(shù)水溶性的不能通過特異機制清除的肽類被認為是通過內吞作用進入肝細胞?！袷荏w介導的內吞繼以溶酶體的分解作用適用于解釋多種藥物的肝臟代謝機制這些藥物有神經生長因子，絨毛膜促性腺激素、催乳素、促甲狀腺釋放激素、TGF、上皮生長因子等。16

（二）胃腸道對蛋白多肽類藥物的代謝

胃腸道內存在大量代謝蛋白多肽的酶，可分為以下三種類型。胃腸道腔內酶這類酶參與蛋白質的消化，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、-糜蛋白酶、彈性酶以及羧基肽酶A和B。這些酶類分別特異水解疏水性、堿性、大分子疏水性、小分子脂族及芳香族和堿性C-末端氨基酸，上述酶類的典型底物分別為：Z-His-Phe-Phe-oMe，苯甲酰基精氨酸甲酯（BAEE）、苯甲酰基酪氨酸乙酯（BTEE）、Ala-Ala-Ala甲酯、馬尿酸-苯丙氨酸，馬尿酸-精氨酸。17

2.黏膜細胞酶

主要指與刷狀緣膜結合的酶類。刷狀緣膜構成了腸道上皮細胞的腔面，富含有多種酶和轉運蛋白，參與各種蛋白類在細胞表面的代謝轉化和吸收。這些酶類依其作用方式分為4種類型，即氨基肽酶、羧基肽酶、二肽酶及肽鏈內切酶。前三種酶屬于肽鏈端解酶，它們從肽類分子的氨基末端或羧基末端順序水解肽類，氨基肽酶是腸刷狀緣膜中最豐富的酶。盡管某些刷狀緣酶是種屬及底物依賴性的，但總的說來，其對肽類的藥物水解速率遵循下列順序：二肽＞三肽＞大分子肽。18

3.刷狀緣胞液酶

這類酶包括氨基三肽酶、脯氨酸肽酶、脯氨酰肽酶、二肽酶及肌肽酶，其典型的底物分別為：中性二肽、N末端為脯氨酸的三肽、C-末端為脯氨酸/馬尿酸的亞胺二肽、N-末端為脯氨酸/馬尿酸的亞胺二肽、肌肽（-丙氨酰組氨酸）。胞液酶優(yōu)先水解二肽，對二肽的水解能力超過對三肽和大分子肽。19

(二)腎臟對蛋白多肽的代謝

腎臟是最重要的蛋白分解代謝的器官之一，特別是分子量低于60kDa的蛋白。通常，血循環(huán)中的肽類和蛋白能夠自由地通過腎小球濾過，肽類可在刷狀緣膜水解，其水解產物，游離氨基酸及短鏈多肽通常不經溶酶體的分解而通過近曲小管進入血液，當這些多肽分子量接近3~5kD或更大時，則往往在近曲小管的刷狀緣膜被內吞（而不是水解）并隨后被溶酶體消化，生成的游離氨基酸和短鏈多肽返回血液循環(huán)中。20

(三)其他器官組織對蛋白多肽的代謝

由于蛋白水解酶的普遍存在性，蛋白多肽藥物在體內的代謝部位極其廣泛。在肝、腎和腸道以外的組織也都存在各種水解蛋白多肽的酶，即使在一般認為蛋白水解酶活性較低的皮膚，也發(fā)現(xiàn)降解肽類的酶屏障，皮膚中的酶代謝活性主要在表皮，在培育的小鼠角質細胞和小鼠表皮的勻漿中測得了氨基肽酶的亞細胞分布。21

三、蛋白多肽類的化學結構和化學修飾對其體內過程的影響（一）糖蛋白分子中糖基的作用

近年，大量細胞因子被開發(fā)，它們在化學結構上屬于糖蛋白。糖基在糖蛋白的體內血漿時程的調節(jié)中起著重要的作用。典型的藥物為

紅細胞生成素（Erythropoietin,EPO）為含唾液酸的糖蛋白激素，分子中約40%為糖類，包括一個O-聯(lián)結和三個N-聯(lián)結的寡糖。該激素的糖基在體內外活性表達中十分重要，業(yè)已表明，這些糖基是EPO體內活性所必需。不含唾液酸的EPO在體內無活性，這種活性的喪失可通過脫唾液酸EPO從血循環(huán)的快速清除加以解釋。該蛋白脫去唾液酸后暴露出半乳糖殘基，后者能為肝細胞表面存在的半乳糖受體識別，從而促進了EPO被肝細胞半乳糖結合受體的結合和內吞，繼被溶酶體消化。22

在大鼠肝灌流系統(tǒng)，脫唾液酸的天然和重組人EPO的血漿消除比完整的EPO快，原形EPO的分布半衰期和清除半衰期分別為53分鐘和180分鐘，而脫唾液酸EPO的消除半衰期僅為2分鐘。大鼠靜脈滴注125I標記的rhEPO后其消除緩慢，血漿半衰期約為2小時，而脫唾液酸EPO則在10分鐘內迅速自血循環(huán)中清除，給藥后30分鐘85%的注射劑量在肝內被回收。近年許多重組細胞因子被研制，它們多數(shù)在血循環(huán)中不穩(wěn)定或引起不良反應，但EPO的臨床治療獲得較大成功，一方面由于EPO指向于特定的成紅細胞，另一方面則由于其體內較穩(wěn)定。這種穩(wěn)定性主要取決于分子中高比例的糖類的存在，從而逃脫肝細胞的攝取。23

（二）氨基酸殘基對寡肽的肝清除的影響

肽類分子中氨基酸殘基對肽類的肝清除速率有顯著影響。●隨著丙氨酸數(shù)目的每一增加即伴有肽消失速率的顯著增加；●相反，隨著甘氨酸殘基數(shù)目的每一增加，肽的消失速率顯著減少。24

（三）蛋白多肽一級結構的PEST假設

Roger等通過文獻資料的總結發(fā)現(xiàn)，那些在真核細胞內快速分解的蛋白質分子結構通常含有共同的氨基酸序列，此即所謂PEST假設。該假設認為細胞內半衰期短于2小時的蛋白質的氨基酸序列具有一個或一個以上富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的區(qū)域[9]?！襁@些富含PEST的區(qū)域的兩側通常（但不總是）有數(shù)個帶正電荷的氨基酸組?！袼械腜EST區(qū)域的共同點是局部高度集中的P、E、S或T，而天冬氨酸較少。

PEST序列能夠賦予蛋白多肽的快速分解確切機制尚未明確,然而，人們發(fā)現(xiàn)短壽的蛋白質的分解需要的Arrhenius激活能（Ea）僅為10~15kcal/mol，長壽蛋白的分解所需的Ea接近30kcal/mol。

這種不同提示存在2種分解通路，各具不同的速率限定性步驟。PEST區(qū)給予蛋白一種快速降解的易感性，從而更易發(fā)生胞內蛋白水解。25

（四）體內蛋白的化學修飾1.體內蛋白化學修飾的含義

少許的化學修飾是導致蛋白水解的首要過程。體內蛋白的化學修飾促進了蛋白的水解，即經修飾的蛋白的降解速率大于相應的未修飾的即天然的蛋白質26

已知至少有9種這樣的化學修飾，又稱“標示步驟”（markingstep），能夠易化蛋白的水解，這些包括：●絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化，●半胱氨酸殘基的混合二硫化物衍生物的形成●賴氨酸殘基氨甲酰化、●非血紅素鐵硫中心的氧化、●賴氨酸的-氨基與泛素的結合●甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜、●谷氨酰胺和天冬酰胺殘基的脫酰胺基●糖基化●細胞色素P450酶系統(tǒng)對氨基酸的氧化。在以上化學修飾中引人注目的是細胞色素P450酶系統(tǒng)27

2.化學修飾加速蛋白水解的機制

影響這種伸展型與折疊型之間的平衡的眾多因素可影響蛋白降解的速率。化學修飾可使這種平衡移向伸展型，從而使伸展型濃度較高。天然的蛋白往往以折疊型存在，從而處于一種局部的最低能量構象，在天然狀態(tài)和伸展狀態(tài)之間能量相差5~15Kcal/mol，從而使得這兩種狀態(tài)的相互轉化十分快速。研究表明，在決定蛋白水解的易感性中，折疊型和伸展型之間的平衡可能較天然蛋白構象本身還更為重要，故整個降解速率受平衡時伸展型濃度的控制。蛋白起初的水解性裂解是蛋白降解速率的決定性因素，且裂解最可能發(fā)生在蛋白瞬間處于伸展或部分伸展狀態(tài)的那一時刻，存在的非天然蛋白量的增加可能導致降解的增加。28

3.蛋白氧化與蛋白多肽藥物代謝之間的關系

MFO催化的蛋白氧化是蛋白降解的一個信號，蛋白的更新將受那些能夠影響MFO活性的因素的影響，因而，某些食物以及藥物的攝入能夠影響蛋白的降解，能夠誘導P450系統(tǒng)藥物，如巴比妥類就可能導致蛋白降解增加，有報道將環(huán)己苯巴比妥加至重建的P450系統(tǒng)，則谷氨酰胺合成酶的氧化失活增加3倍。29

第2節(jié)蛋白多肽類藥物的藥物代謝動力學特點及其影響因素

一、蛋白多肽類藥物的代謝動力學特點（一）顯著的首關效應

和小分子合成藥物相比，蛋白多肽類藥物口服具有十分明顯的首關效應，由于這類藥物在胃酸中的不穩(wěn)定性及胃腸道和肝臟中普遍存在的蛋白水解酶，使這類藥物在到達體循環(huán)前大量降解而致生物利用度極低，故絕大部分蛋白多肽類采用胃腸外給藥途徑，特別是靜脈注射給藥

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（二）消除半衰期短

由于這類藥物體內迅速降解，導致原形藥物的體內存留時間甚短，通常半衰期僅為數(shù)分鐘或0.5~1.0小時左右，如胰島素在人體半衰期不到9分鐘，靜脈注射后1小時幾乎所有胰島素被清除，組織型纖溶酶原激活物（t-PA）半衰期為26-55分鐘，水蛭素（hirudin）為60-100分鐘。這種短半衰期迫使它們在臨床應用時不得不采用靜脈滴注或多次頻繁給藥，以維持恒定的有效血藥水平。31

（三）表觀分布容積通常較小

這類藥物通常水溶性較強，親脂性較差，不易透過細胞膜和生理屏障，故多數(shù)藥物的表觀分布容積相當于細胞外液體積。如水蛭素在人體的表觀分布容積約為0.28L/kg，相當于細胞外液體積。這類藥物在血液中的濃度往往較高，而在腦組織中的濃度較低。32

（四）非線性動力學性質

蛋白多肽類藥物的吸收、結合和消除均可能涉及非線性飽和動力學。125I-rhTNFDa小鼠iv25、67.5和152g.kg-1-的125I-rhTNFDa后曲線下面積分別為41、180和526g.L-1.h-1，清除率分別為0.66、0.41和0.31L/h·kg，說明隨劑量增加，125I-rhTNFDa顯示非線性藥動學。rh-sc-uPA獼猴靜脈注射重組單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（rh-sc-uPA）后t1/2和MRT隨劑量增加而延長，藥-時曲線下面積明顯大于劑量的增加，全身清除率（CLs）隨劑量增加而減慢，提示研究劑量范圍內可能涉及多個酶反應，為劑量依賴性非線性動力學過程。33

又如肝細胞增殖因子（HGF）用酶聯(lián)免疫法檢測其血漿中濃度變化時發(fā)現(xiàn)，HGF的特異性清除和非特異性清除均顯示非線性。iv低劑量（1－3g·kg-1）HGF后，分析其血漿清除率的變化時發(fā)現(xiàn)，此時主要是HGF與其受體的結合發(fā)生飽和，即特異性清除發(fā)生飽和，iv高劑量（0.3-1mg/kg）時，不僅HGF與其受體的結合發(fā)生飽和，HGF與HSPGs的非特異性結合也發(fā)生了飽和。34

二．蛋白多肽類藥物藥動學的影響因素（一）結合蛋白的影響

蛋白結合是眾所周知的小分子外源性化學藥物的非特異性現(xiàn)象，但對蛋白多肽類藥物而言，這一結合現(xiàn)象多為特異性蛋白引起的，▲受體▲抗體●結合成為一種生理作用，這些結合蛋白往往是生理學上具有活性的蛋白多肽類物質的轉運者、激活物以及調節(jié)劑。它們可在細胞水平調節(jié)治療性蛋白多肽藥物的效能，●可影響這類藥物的體內過程和藥動學行為，特別是可影響治療性蛋白多肽的體內清除并干擾其體液分析?！裨谀承┣闆r下，結合蛋白作為一種儲存庫使其體內存留時間延長，相反，結合蛋白也可成為其清除機制而加速這類藥物自機體的清除。35

（二）種屬特異性

和小分子化合物不同，蛋白多肽具有結構和活性種屬特異性，特別是氨基酸序列，對于相同的實體在不同種屬之間有所不同，這就有可能使得一種活性蛋白在不同種屬試驗時變得無活性，且成為一種異物而導致免疫原反應。例如，干擾素α或紅細胞生成素天然情況下是糖基化的，而其他一些如生長激素和胰島素則非糖基化。業(yè)已發(fā)現(xiàn)糖基化程度亦有種屬特異性，加入糖基的緣由尚未充分了解，糖基能夠保護蛋白免遭降解和抗原識別。除去糖基后蛋白的清除率既可改變，也可不發(fā)生改變，因而在開發(fā)一種糖基化蛋白時需要對此進行研究，因為哺乳動物蛋白的克隆大部分在細菌細胞中完成的，得到的是非糖基化產物。36

（三）給藥方案依賴性藥物作用

●蛋白治療藥物的給藥方案可影響該類藥物的藥效動力學，特別是蛋白激素類，這些激素生理情況下的分泌具有生理節(jié)律性，●外源性蛋白治療藥不同給藥速率和方式可產生不同的作用。

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如生長激素釋放激素（GRF）半衰期很短，僅為數(shù)分鐘，按傳統(tǒng)的藥動學原理，GRF應連續(xù)或多次給藥以維持恒定的血藥濃度，但這與其作為生長促進劑的臨床應用相矛盾?！斶B續(xù)或脈沖式靜脈給藥后，GRF變得無效，不能維持生長激素的釋放，▲每天一次或兩次單劑推注，則能刺激生長激素的釋放。又如生長激素（GH），實驗研究表明垂體切除的大鼠中，▲每日一劑GH引起體重和骨骼生長速率的顯著增加，相同劑量的GH以每日9次脈沖式給藥使體重增加，骨骼生長速率增加27%以上，▲CH連續(xù)靜脈給藥導致生長速率的顯著降低。促性腺激素釋放激素▲連續(xù)給藥導致促性腺激素分泌抑制，▲脈沖式給藥則能最有效的促進性腺激素的釋放。黃體生成素釋放激素（LHRH）▲以生理脈沖頻率（每90分鐘一次）短期、小劑量給藥時，對垂體性腺系統(tǒng)起促進作用，▲以非生理脈沖頻率長期大劑量給藥可以致垂體分泌黃體生長素（LH）和卵泡刺激素（FSH），引起性腺分泌激素能力下降和性器官萎縮。這種給藥方案依賴性作用亦見于甲狀旁腺激素、松弛素、組織型纖溶酶原激活物等。38

（四）蛋白的免疫原性

●

可誘發(fā)機體產生抗體，抗體的存在能夠失活（中和）蛋白藥物的生物活性，影響蛋白藥物的體內分布，代謝和排泄，甚至或可能引起繼發(fā)性不良反應和疾病，從而使得臨床前和臨床研究的結果變得難以解釋。▲抗體對蛋白藥物的失活可通過封閉蛋白藥物分子中的活性中心或通過對活性以外的更為遠離的部位的結合改變蛋白的三級結構，即立體效應而導致蛋白藥物活性的喪失?！贵w除可中和蛋白藥物的生物活性外，還可通過影響其藥代動力學而進一步影響蛋白的效能，這種影響表現(xiàn)為增加或減少抗原-抗體復合物的清除，如果生成的抗原-抗體復合物較未結合藥物本身清除更快，則蛋白藥物可因這種結合而失活，不論這種抗體是中和性的還是非中和性的。39

（五）內源性干擾

●內源性成分對外源性蛋白的藥代動力學產生干擾，因而在闡明外源性給予的蛋白藥物的確切藥代動力學時，內源性物質的影響必須予以控制，如通過靜脈滴注葡萄糖和生長激素抑制素以抑制胰島素和生長激素的內源性釋放，從而使得有可能對外源性胰島素和生長激素的藥代動力學作出確切解釋。還要考慮的是●外源性給予的是藥理劑量，而非生理劑量，藥理劑量的蛋白質能改變蛋白質的體內過程，因機體會將藥理劑量視為生成過度而作出調節(jié)反應?！駲C體暴露于高濃度的蛋白藥物可能導致不可預測的不良反應。這些均可影響蛋白多肽類藥物的藥動學。40

（六）給藥系統(tǒng)

1.緩釋注射給藥系統(tǒng)

埋植劑和微球注射劑兩種，其中以微球注射劑最為引人注目。在諸多多肽緩釋注射劑中研究得最為成功的品種為黃體生成素釋放激素（LHRH）及其類似物曲普瑞林（triptorelin）、亮丙瑞林（leuprorelin）、布舍瑞林（baserelin）、高舍瑞林（goserelin）那法瑞林（nafarelin）LHRH在體內易被酶降解，半衰期極短，僅3.5-5分鐘，當用于抑制垂體-性腺系統(tǒng)功能時，需要每日給藥，一個療程3－6個月。上述緩釋制劑均以聚乳酸-羥乙酸(PLGA)為骨架材料，制成緩釋制劑，其半衰期分別延長至8、16、30、80和144分鐘，丙氨瑞林（LHRH-A,alarelin）是天然LHRH的九肽擬似物，活性為LHRH的15~20倍。為我國自行研制的Ⅰ類新藥。該藥為以PLGA為載體的長效微球，聚合物骨架能夠保護微球內部藥物不被降解，可緩釋一個月。納米粒給藥系統(tǒng)近年快速發(fā)展的納米粒給藥系統(tǒng)在蛋白多肽類藥物的體內傳輸中有著極廣闊的應用前景，可有效延長這類藥物的體內釋放，避免酶的降解，提高生物利用度。41

2.口服給藥系統(tǒng)

數(shù)十年來人們一直致力于尋找適合于蛋白多肽類藥物的非注射給藥系統(tǒng)，其中主要是口服給藥系統(tǒng)，其采用的策略主要是：加入蛋白酶抑制劑，吸收促進劑和穩(wěn)定劑以克服口服吸收中遇到的屏障作用；●腸溶包衣技術●微囊、微球技術及微乳技術；●部位特異性結腸給藥技術；●其他特殊技術，如人體紅細胞載體，具受體介導吞飲機制的蛋白結合物等。胰島素口服給藥系統(tǒng)的研究在所有蛋白多肽類藥物中最為突出。42

3.其他非注射給藥系統(tǒng)

在蛋白多肽的非注射給藥系統(tǒng)中，鼻黏膜給藥備受關注?！褚葝u素鼻腔給藥生物利用度達10%~30%，在美國已有商品出售。腦啡肽類似物和胰高血糖素生物利用度則高達70%~90%。●胰島素制成氣霧劑噴霧吸入在兔體內生物利用度達57%，●直腸給予四胃泌素（Tetragastrin）和胰島素的生物利用度分別達16%和28％?！耜幍鲤つそo予LHRH類似物生物利用度達40%－90％。43

4.蛋白多肽的化學修飾

改善蛋白多肽類藥代動力學性質的一個主要手段是對這類藥物分子進行化學修飾，主要將蛋白多肽與生物可降解的高分子可溶性載體（聚合物）結合形成蛋白質-聚合物共軛體，常用的載體（聚合物）為●右旋糖酐、●白蛋白44

●聚乙二醇（PEG），以PEG應用最為廣泛。▲PEG具有良好的水溶性，用適當方法活化后可與各類蛋白偶聯(lián)，▲PEG無毒，▲良好的生物相容性，從而使其成為最廣泛使用的蛋白化學修飾劑?！鳳EG與蛋白多肽以共價鍵形成的軛合物的性質較未修飾的原蛋白多肽很大改善，表現(xiàn)為◆溶解度增高，◆分子量加大，◆穩(wěn)定性增強，◆藥物血循環(huán)中存留時間延長，生物半衰期延長，◆生物利用度提高，◆免疫原性和過敏反應降低甚至消失，而活性基本不變。45

人工重組白細胞介素-2（rhIL-2）利用PEG5000修飾后，使其由疏水性變成親水性，體內半衰期顯著延長，在HIV感染患者可每周一次給藥。腺苷脫氫酶（ADA）經PEG修飾后該酶可在血液中存留1~2周，抗原反應降低，而未修飾的ADA進入血液后數(shù)分鐘內即被肝臟清除。r-水蛭素消除半衰期僅為50~100分鐘，但制成的2：1的聚乙二醇重組水蛭素結合物（PEG-hirudin）單劑iv后T1/2a為1~3h，T1/2B延長至12小時，有希望成為1日1次給藥的長效抗凝抗栓藥物。46

組織型纖溶酶原激活物尿激酶鏈激酶葡激酶彈性蛋白酶蝮蛇抗栓酶超氧化物歧化酶L-天冬酰胺酶無基質牛血紅蛋白牛血清白蛋白白細胞介素-2腫瘤壞死因子-抗腫瘤抗體β-葡糖苷酸酶抗體等通過與PEG形成結合物后其藥動學和藥效學性質均大大改善。47

5.前體藥物的應用

將蛋白多肽藥物制成抗酶前體藥物以及親脂性更強的前體藥物，有利于抵抗蛋白酶的降解破壞以及增加親脂性而提高生物利用度。48

6.脂質體

作為藥物載體的脂質體受到廣泛重視，如IL-2，IFN，天門冬酰胺酶被包埋在脂質體內都表現(xiàn)出較長的半衰期，釋放延緩，藥效提高的特點，胰島素與脂質體結合或混合后均有抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶降解作用，脂質體不僅能保護被包埋的蛋白多肽藥物，延長半衰期，還可提高其靶向性，并能促進蛋白多肽類藥物的透皮吸收。

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第3節(jié)生物樣品中蛋白多肽類藥物的分析方法和傳統(tǒng)藥物比較，蛋白多肽類藥物的檢測面臨相當大的難度，其主要原因是：●這類藥物多為生理活性物質，化學結構特殊，穩(wěn)定性差，體內處置十分復雜?！裆矬w內存在大量干擾物質，如結構相同或相似的內源性蛋白多肽類物質，細胞因子、蛋白類治療藥物降解產物、體液基質、體內結合蛋白以及針對治療藥物的抗體等。故要求檢測方法應高度特異。如何特異地將目標蛋白多肽分子與干擾物質區(qū)分是迄今為止尚未完全解決的一大難題?！裨擃愃幬锷砘钚詮?，用藥劑量很小，通常為微克級水平，致體液中藥物濃度極低，故要求檢測方法必須具有極高的靈敏度。由于存在以上困難，致使通常采用的方法如HPLC、GC不適用。目前尚無一種完全滿足蛋白多肽藥代動力學研究要求的分析方法。50

Challenge&Opportunity人用藥物注冊國際協(xié)調會議（ICH）對生物技術藥物臨床前安全性評價提出:●“在科學基礎上的靈活性和具體情節(jié)個別處理”的總則(casebycase)。●通常將幾種方法聯(lián)合使用，互為補充以獲得較可靠的結果。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，已為蛋白多肽類藥代動力學研究提供了多種分析手段。51

一.生物檢定法定義：該法是利用在體和體外組織或細胞對被測活性蛋白多肽類藥物的某種特異反應，通過劑量（或濃度）-效應曲線對目標蛋白多肽進行定量測定的一種分析方法。

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這類測定方法又分：▲離體組織（細胞）培養(yǎng)技術以細胞增殖、分化或細胞毒性為基礎，以細胞數(shù)目的增減為量效指標。隨著分子生物學的發(fā)展，許多依賴性細胞株被建立，從而增強了特異性和靈敏度。如rhIL6和rhTNFDa的藥動學研究文獻報導曾分別采用rhIL6依賴性細胞株7TD1和TNF敏感細胞株L929測定給藥后血清藥物濃度時間變化?！羌毎囵B(yǎng)方法（蛋白多肽的特異生物學反應）如水蛭素的藥動學研究可利用其抗凝活性進行，如凝血酶時間測定法、生色底物法和蝰蛇毒測定法等；纖溶酶原激活物利用其溶栓作用采用纖維蛋白平板法測定?！x體組織進行分析如催產素采用離體子宮法；▲在體分析法，如胰島素的小鼠血糖法等。53

優(yōu)點是測定藥物的生物活性，缺點①缺乏特異性，不能定量失去活性的代謝產物，不能區(qū)分內源性和外源性細胞因子；②靈敏度差，為起動生物過程，細胞因子的濃度必須在閾水平以上，低于閾水平的樣品將不能被定量，從而降低了方法的靈敏度；③耗時，為完成分析需時間較長，往往達數(shù)日或數(shù)周；④不同實驗室的結果有很大差異性，致不同單位之間的比較難以進行，這種差異性可能來自細胞傳代的差異或細胞對某種生物學作用產生的獲得抵抗性。54

二、免疫測定法

定義：利用直接針對被分析蛋白質、多肽上的不同抗原決定簇部位的單克隆抗體或多克隆抗體特異地識別被分析的目標蛋白質，再以放射計數(shù)、比色等方法予以定量。該法系將抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常用方法有以下三種（參見第18章）。55

（一）放射免疫測定法(RIA)

該法系將固定微量的標記抗原(多為125I-Ag)和待測抗原(藥物)與已知限量的抗體(Ab)起競爭性結合反應，待測抗原含量與標記抗原-抗體復合物的放射強度成反比。這是將同位素測量的高度靈敏度和免疫學抗原-抗體結合反應的高度特異性相結合的一種超微量分析方法，方法的特異性取決于抗原的親和力。56

（二）免疫放射定量法(IRMA)

為近年發(fā)展的新方法，和RIA相似之處是同為競爭性蛋白結合測定法，但不同的是IRMA將已知的特異性單克隆抗體包被在固相載體上，形成固相抗體(Ab)，加入待測血清(含待測抗原Ag)，Ag與固相Ab結合形成Ag-Ab復合物，再加入過量的特異性125I標記單克隆抗體Ab※，形成Ab-Ag-Ab※夾心狀復合物，故具有較高的特異性，且靈敏度亦較RIA高。57

（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)

該法的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記，結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保持其免疫性，又保留酶的活性。在ELISA法中，以雙抗體夾心法測抗原應用最廣泛，將已知的特異性抗體包被在固相載體上，形成固相抗體，加入含相應抗原Ag的待測標本，Ag與固相Ab結合成復合物，再加入特異性酶標抗體，后者與已形成的Ag-Ab復合物結合，加入酶的相應底物，根據(jù)酶催化底物顯示的顏色深淺對待測物進行定性和定量，(圖8-1)

。58

+底物固相Ab標本（含Ag）Ag-Ab復合物酶標AbAb-Ag-Ab-酶復合物

圖8-1雙抗體夾心ELISA法示意圖++顯色59

目前ELISA法已成為一種“備選方法”而被廣泛用于蛋白多肽類藥物的藥物動力學研究，這是由于該法具有以下優(yōu)點：●高度的靈敏度由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫學反應的結果。如白介素-5，用雙抗體夾心ELISA法的檢測限低至7.8pg/ml，較應用鼠BCL1細胞的生物檢定法靈敏10000倍?！褫^高的特異性由于應用抗原抗體反應故和生物檢定法相比特異性較高?！褚子诓僮鳌⒖焖?、不使用同位素、無輻射源，適用于批處理?！裨噭┦褂脡勖L。

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免疫測定法存在以下缺點：●該法測定的是待測蛋白多肽的免疫活性而非生物活性?！裨摲ú荒軐Φ鞍锥嚯淖鞒鲫栃澡b定，如確切的生化組成和序列?！褚资芏喾矫嬉蛩氐母蓴_：▲一種形式的干擾來自代謝產物，如果它們在原形藥的免疫測定中具有交叉反應性，就能顯著干擾生物利用度的測定。▲另一種干擾來自抗體的形成，這在臨床前研究尤為突出，因為給予的人蛋白對動物明顯是外源性的。這些抗體可能是中和性的或非中和性的，它們可影響蛋白多肽類藥物的清除和藥理作用，并對其定量測定產生影響。▲結合蛋白的存在也能夠構成蛋白多肽類藥物測定的嚴重的干擾，甚至可使直接的免疫學測定毫無價值。對于低親和力結合蛋白的干擾可用稀釋法加以克服，但樣品的稀釋可降低檢測的靈敏度；稀釋法不能克服高親和力結合蛋白的干擾，可能需要采用抽提的方法以排除這些干擾?！|效應免疫學測定還受基質特異的影響，生物體液以及緩沖液的不同往往能夠改變蛋白的反應性，某些可通過向