尿激酶對大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的影響

尿激酶對大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的影響【摘要】目的：研究尿激酶對大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的影響.方法：將大鼠胸膜FB原代培養(yǎng)，4～12代用于實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)B與不同濃度UK共培養(yǎng)24～96h；用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變；熒光染色查找凋亡小體；流式細(xì)胞技術(shù)觀察有無凋亡細(xì)胞出現(xiàn).結(jié)果：UK以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制細(xì)胞生長，但未發(fā)現(xiàn)凋亡小體，流式細(xì)胞技術(shù)沒有檢測到凋亡細(xì)胞.結(jié)論：UK能夠抑制FB增殖，其機(jī)制與細(xì)胞凋亡無關(guān).

【關(guān)鍵詞】尿激酶；胸膜;成纖維細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

胸膜纖維化是難治性胸膜炎的病理基礎(chǔ)，胸膜成纖維細(xì)胞增殖又是胸膜纖維化的主要原因.目前，臨床上應(yīng)用尿激酶防治炎性胸膜炎形成胸液包裹、胸膜黏連、肥厚等獲得了明顯效果，但機(jī)制不甚明確［1-3］.因此，我們以研究大鼠胸膜FB為治療靶位，觀察UK對大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用，探討作用機(jī)制，為UK防治炎性胸膜炎提供理論依據(jù).

1材料和方法

材料健康雄性SD大鼠1只,體質(zhì)量160g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；UK(遼寧天龍藥業(yè)有限公司)；丫啶橙，MTT；小鼠抗大鼠波形蛋白mAb,小鼠抗大鼠角形蛋白mAb,小鼠抗大鼠第Ⅷ因子相關(guān)抗原mAb,小鼠抗大鼠CD45抗原mAb(武漢博士德生物工程有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；酶連免疫檢測儀(國營華東電子管廠)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司).

方法

胸膜FB的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定用脊椎脫臼法處死SD雄性大鼠，無菌剝離胸膜，剪成1mm×1mm×1mm左右的碎塊，均勻鋪滿培養(yǎng)瓶底，加入含100mL/LFBS的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃,50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，g/L胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)，自然純化.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài)，對第4代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定，以卵蛋白生物素過氧化物酶復(fù)合法(ABC)法分別用抗細(xì)胞波形蛋白、抗細(xì)胞角形蛋白、抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原和抗CD45抗原的小鼠抗大鼠mAb作免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定胸膜FB.

法觀察UK對大鼠胸膜FB增生的作用以g/L胰蛋白酶消化第4～6代大鼠胸膜FB,將單細(xì)胞懸液以5×107/L密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200μL，37℃，50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，2～3d后細(xì)胞長滿96孔培養(yǎng)板的1/2，再用無血清的RPMI1640培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期.然后更換培養(yǎng)液，加入含有不同濃度UK的培養(yǎng)基，設(shè)12個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，48，72，96h.實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清，每孔加入150μLDMSO，振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔A490nm值.以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線.

觀察UK對大鼠胸膜FB凋亡的作用

光鏡形態(tài)學(xué)觀察在6孔培養(yǎng)板中加入蓋玻片，細(xì)胞長滿后加入不同濃度的UK，不加藥孔為對照組，24h后收集蓋玻片，PBS沖洗，純丙酮固定8min，用1g/L的蘇木精,g/L的伊紅常規(guī)染色、脫水、透明、封片.光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變.

細(xì)胞熒光染色分別收集經(jīng)不同濃度UK處理24h的細(xì)胞，加入100mg/L丫啶橙熒光染色液染色10min，CaCl2分化，熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察.

流式細(xì)胞儀結(jié)合PI及AnnexinVFITC雙標(biāo)記染色測定細(xì)胞凋亡選對數(shù)生長晚期的細(xì)胞，分別加入5×103，10×103，20×103，30×103U/mLUK，24h后將5×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，用50μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每組分別加入PI及AnnexinVFITC，室溫避光30min上樣，立即用流式細(xì)胞儀分析凋亡率.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS軟件分析，組間比較采用OnewayANOVA檢驗(yàn).

2結(jié)果

胸膜FB鑒定結(jié)果FB經(jīng)8～10ｄ培養(yǎng)后鋪滿瓶底，在倒置顯微鏡下見細(xì)胞呈梭形，胞核卵圓形，位于細(xì)胞中央，呈放射狀或柵欄狀排列.成纖維細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后抗細(xì)胞波形蛋白抗原陽性，抗細(xì)胞角蛋白陰性，抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性，抗CD45抗原陰性，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為大鼠胸膜FB.

對大鼠胸膜FB增生的抑制作用UK作用后，所有加藥組A490nm值均低于對照組.其中，5×106，10×106，20×106，30×106U/LUK較對照組降低顯著，顯示UK以時(shí)間和劑量依賴方式抑制細(xì)胞增殖.

對大鼠胸膜FB凋亡作用的影響光鏡形態(tài)學(xué)觀察對照組大鼠胸膜FB大多數(shù)呈梭形，胞核卵圓形，位于細(xì)胞中央，呈放射狀或柵欄狀排列.UK作用24h后，未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞.熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察對照組大鼠胸膜FB大多數(shù)呈梭形，胞核卵圓形，位于細(xì)胞中央，呈放射狀或柵欄狀排列.UK作用大鼠胸膜FB24h后，細(xì)胞核完整，未見凋亡形態(tài)細(xì)胞.凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞技術(shù)檢測示UK作用大鼠胸膜FB24h后,無明顯凋亡細(xì)胞出現(xiàn).

3討論

細(xì)胞凋亡在胸膜炎發(fā)生中的作用正逐漸引起了人們的關(guān)注.由于尿激酶能非特異性將纖溶酶原激活成纖溶酶，纖溶酶可降解胸膜腔內(nèi)的纖維蛋白，從而達(dá)到降低胸膜腔積液黏稠性，清除胸膜的粘連和間隔形成，保證胸膜腔積液引流通暢，增加胸膜腔引流，使肺得以重新復(fù)張［4］，臨床廣泛使用尿激酶注入胸膜腔防治胸膜粘連.但其作用機(jī)制復(fù)雜，尿激酶是通過抑制大鼠胸膜FB分泌炎性介質(zhì)，還是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，仍不甚清楚.因此，研究UK對FB的生長抑制作用和凋亡作用，為UK治療炎性胸膜炎提供新的理論依據(jù).

胸膜為中胚層的漿膜，含有單層間皮細(xì)胞，被覆在胸內(nèi)壁和肺表面的結(jié)締組織上.胸膜成纖維細(xì)胞是胸膜的結(jié)構(gòu)及效應(yīng)細(xì)胞，已證實(shí)胸膜內(nèi)ECM合成的主要細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，它的活化、增殖以及通過釋放介質(zhì)使ECM產(chǎn)生增多在胸膜纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用，而胸膜成纖維細(xì)胞的活化、增殖機(jī)制是受體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的.成纖維細(xì)胞可分泌多種生長因子和膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維，影響胸膜的修復(fù)和組織再生.不僅如此，F(xiàn)B還是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，它可以通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)增強(qiáng)和維持組織炎癥反應(yīng)，從而有可能參與胸膜的慢性炎癥.

我們通過MTT法觀察UK對大鼠胸膜FB作用24～96h發(fā)現(xiàn)，所有加藥組A490nm值均低于對照組，顯示UK以時(shí)間和劑量依賴方式抑制細(xì)胞增殖.在光鏡下UK并沒有誘導(dǎo)大鼠胸膜FB出現(xiàn)核濃縮、核碎裂和染色質(zhì)邊集等凋亡細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)特征；其次熒光鏡下未見到核碎裂的凋亡細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞技術(shù)也沒有觀察到凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，再次證明UK抑制大鼠胸膜FB增殖與細(xì)胞凋亡無關(guān).我們通過MTT法觀察到UK以時(shí)間和劑量依賴方式抑制大鼠胸膜FB增殖，但沒有加速細(xì)胞凋亡，其抑制細(xì)胞增殖的可能機(jī)制分析TGFβ1是由激活的巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,FB等分泌的一種致纖維化細(xì)胞因子，可促進(jìn)FB的增殖，且隨劑量的增加，促增殖效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)［5］.在體內(nèi)，肺組織發(fā)生纖維化時(shí)，TGFβ1及其mRNA增加最顯著［6］.bFGF是一種前纖維化因子，可促進(jìn)膠原基因啟動(dòng)，從而形成纖維化病變.FB,內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞,肥大細(xì)胞等都能合成bFGF，它又能刺激這些細(xì)胞的增殖［7］.外源性UK可導(dǎo)致胸膜FB和間皮細(xì)胞TGFβ1，bFGF表達(dá)減少［8-9］，提示此類藥物可能通過刺激促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)減少而抑制FB的增殖.

實(shí)驗(yàn)表明，尿激酶可抑制大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增生，但不能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡樣改變，提示尿激酶可以干預(yù)胸膜重建中的結(jié)構(gòu)改變及大鼠胸膜成纖維細(xì)胞的增生、肥大，但尿激酶抑制大鼠胸膜成纖維細(xì)胞增生，不是通過誘導(dǎo)FB凋亡產(chǎn)生的，可能通過減少FB分泌炎性介質(zhì)，間接參與胸膜重建，這為尿激酶治療胸膜纖維化提供了新的理論依據(jù).

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