微生物學(xué)第八章微生物與基因工程

關(guān)于微生物學(xué)第八章微生物與基因工程第1頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因工程是指對(duì)遺傳信息的分子操作和施工。即把分離的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的基因產(chǎn)物或者令生物表現(xiàn)出新的性狀。其核心是構(gòu)建重組體DNA技術(shù)。簡(jiǎn)單地說基因工程就是運(yùn)用重組DNA技術(shù)改造生物的性狀。第2頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因工程是一種DNA的體外重組技術(shù)，是根據(jù)人們的需要，在分子水平上用人工方法取得供體DNA上的基因，在體外重組于載體DNA上，再移入原體細(xì)胞，使轉(zhuǎn)錄翻譯及復(fù)制，表達(dá)出供體基因原有的生物學(xué)特性。這種使DNA分子進(jìn)行重組，再在受體細(xì)胞內(nèi)無性繁殖的技術(shù)也被稱為分子無性繁殖或分子克隆、重組DNA技術(shù)。

通過基因工程改造后的菌株被稱為“工程菌”。第3頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因工程是一門嶄新的生物技術(shù)。它的出現(xiàn)標(biāo)志著人類已經(jīng)能夠按照自己意愿進(jìn)行各種基因操作，大規(guī)模生產(chǎn)基因產(chǎn)物，并可設(shè)計(jì)和創(chuàng)建新的蛋白質(zhì)和新的生物物種。第4頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA的特異切割、DNA分子克隆、DNA快速測(cè)序這三項(xiàng)技術(shù)的建立為基因工程奠定了基礎(chǔ)。第5頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一節(jié)

微生物與基因工程的關(guān)系

微生物與基因工程的關(guān)系密切，基因工程的產(chǎn)物和發(fā)展依賴于微生物學(xué)的理論和技術(shù)。微生物在基因工程中的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用?？梢哉f一切基因工程操作都離不開微生物。

第6頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三①基因工程所用載體不是微生物就是微生物的質(zhì)粒。

②基因工程所用的千余種工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化得到的。

③微生物細(xì)胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和動(dòng)物基因工程也要先構(gòu)建穿梭載體，使外源基因或重組體DNA在大腸桿菌中得到克隆并進(jìn)行拼接和改造，才能再轉(zhuǎn)移到植物或動(dòng)物細(xì)胞中。微生物和微生物學(xué)在基因工程中的重要性第7頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三④為了大規(guī)模表達(dá)各種基因產(chǎn)物，從事商業(yè)化生產(chǎn)，通常都是將外源基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌或者是酵母菌中以構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。

⑤微生物的多樣性，尤其是抗高溫、高鹽、高堿、低溫等基因，為基因工程提供了極其豐富而獨(dú)特的基因資源。

⑥有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和表達(dá)調(diào)控的理論主要是從微生物的研究中取得的，或者是將動(dòng)物、植物基因轉(zhuǎn)移到微生物中后研究而獲得的。第8頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、

微生物與克隆載體克隆載體（cloningvector）：外源DNA片段進(jìn)行克隆，需要一個(gè)合適的載體將其運(yùn)送到細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。這種以擴(kuò)增外源基因?yàn)槟康牡妮d體稱為克隆載體。

把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體（vector）。第9頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三作為克隆載體的條件是：①載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制，因此載體應(yīng)是一個(gè)復(fù)制子；②載體必須具有若干個(gè)限制酶的單一切割位點(diǎn)，便于外源基因的插入。并且這些酶切位點(diǎn)應(yīng)位于載體復(fù)制的非必要去，故插入適當(dāng)大小外源DNA片段后載體仍能進(jìn)行正常的復(fù)制。③載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記。如抗生素的抗性基因等。

第10頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因工程中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括6大類：質(zhì)粒載體；λ噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒載體；M13噬菌體載體；真核細(xì)胞的克隆載體；人工染色體等。第11頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三載體的選擇1）是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子（replicon)2)能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。3）載體上最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。4）載體上必須有一種選擇遺傳標(biāo)記，以便及時(shí)將“工程菌”選擇出來。第12頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、質(zhì)?？寺≥d體（1）、質(zhì)粒載體質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，經(jīng)人工修飾改造后作為克隆載體具有十分有利的特性：①

具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；②

具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，一般不超過15kb；③

具有較高拷貝數(shù)，使外源DNA得以大量擴(kuò)增；④

易于導(dǎo)入細(xì)胞；⑤

具有便于選擇的標(biāo)記和具有安全性。第13頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價(jià)值的克隆載體，具有很多優(yōu)點(diǎn)：①

其分子遺傳學(xué)背景十分清楚；②

載體容量較大，一般質(zhì)粒載體只能容納10多個(gè)kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；③

具有較高的感染效率，其感染宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá)100%，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有0.1%。

但野生型λ噬菌體DNA的分子很大，基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，限制酶有很多切點(diǎn)，且這些切點(diǎn)多數(shù)位于必需基因之中，因而不適于作為克隆載體，必需經(jīng)一系列改造才能用作克隆載體。

構(gòu)建λ噬菌體載體克隆載體的基本原則是：①

刪除基因組中非必需區(qū)，使基因組變小，有利于克隆較大的DNA片段；②

除去多余的限制位點(diǎn)。

第14頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三3、柯斯質(zhì)粒載體

柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvector）即粘粒載體，是由λ噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成?？滤官|(zhì)粒載體含有來自質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記、一個(gè)或多個(gè)限制酶單一位點(diǎn)，以及來自λ噬菌體粘性末端的DNA片段，即cos位點(diǎn)，其對(duì)于將DNA包裝成λ噬菌體粒子是必需的。

柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：①

具有噬菌體的高效感染力，而在進(jìn)入宿主細(xì)胞后不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在；②

具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式，重組DNA注入宿主細(xì)胞后，兩個(gè)cos位點(diǎn)連接形成環(huán)狀DNA分子，如同質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制；③

具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯質(zhì)粒本身一般只有5~7kb左右，而它可克隆外源DNA片段的極度限值竟高達(dá)45kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體及λ噬菌體載體的克隆能力。第15頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三4、M13噬菌體載體M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀ssDNA，大小為6407bp。感染雄性（F+或Hfr）大腸桿菌并進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)變成復(fù)制型（RF）dsDNA，然后以滾環(huán)方式復(fù)制出ssDNA。每當(dāng)復(fù)制出單位長(zhǎng)度正鏈，即被切出和環(huán)化，并立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細(xì)胞不被裂解）釋放至胞外。

野生型M13不適于直接作為克隆載體，因此人們對(duì)其進(jìn)行改造，構(gòu)建了一系列M13克隆載體。第16頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三5、噬菌體質(zhì)粒載體

噬菌體質(zhì)粒（phagemid或phasmid）是由絲狀噬菌體和質(zhì)粒載體DNA融合而成，兼有兩者優(yōu)點(diǎn)，這類載體具有來自M13或f1噬菌體的基因間隔區(qū)（內(nèi)含M13或f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)）和來自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記、一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)等。噬菌體質(zhì)粒載體在應(yīng)用上具有許多優(yōu)點(diǎn)：①載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作；②克隆外源DNA容量較M13噬菌體載體大，可克隆10kb外源DNA片段；③可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達(dá)外源基因。第17頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三6、真核生物的克隆載體真核生物載體，主要有以下幾大類：（1）、酵母質(zhì)粒載體①、附加體質(zhì)粒（epislmalplasmid）②、復(fù)制質(zhì)粒（replicatingplasmid）③、整合質(zhì)粒（integratingplasmid）

（2）、真核生物病毒載體①、哺乳動(dòng)物病毒載體②、昆蟲病毒載體③、植物病毒載體第18頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三7、人工染色體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）是一類目前能容納最大外源DNA片段人工構(gòu)建的載體。酵母染色體的控制系統(tǒng)主要包括三部分：①

著絲粒（centromere,CEN），它的作用是使染色體的附著粒與有絲分裂的紡錘絲相連，保證染色體在細(xì)胞分裂過程中正確分配到子代細(xì)胞；②

端粒（telomere,TEL），位于染色體兩個(gè)末端，功能是保護(hù)染色體兩端，保證染色體的正常復(fù)制，防止染色體DNA復(fù)制過程中兩端序列的丟失；③

酵母自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）其功能與酵母細(xì)胞復(fù)制有關(guān)。第19頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三表達(dá)載體的構(gòu)建

基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌、酵母或動(dòng)、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng)、植物的遺傳性狀。所謂表達(dá)載體（expressionvector）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。也即克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增；表達(dá)載體不僅可使外源基因擴(kuò)增，還可使其表達(dá)。原核生物和真核生物的表達(dá)載體有一些共同的要求，但兩者的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有很大不同，故需要分別采用原核生物和真核生物的調(diào)控原件來構(gòu)建。第20頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件包括：?jiǎn)?dòng)子、核糖體的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)密碼子偏愛性等。第21頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開關(guān)的作用通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長(zhǎng)；此外某些載體的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子，強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)非常強(qiáng)以致使正常宿主基因不能表達(dá)。

基于以上事實(shí)，宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動(dòng)開關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時(shí)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物。在原核基因表達(dá)調(diào)控中，阻遏蛋白－操縱基因系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)開關(guān)的作用。當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因相結(jié)合時(shí)，能夠阻止基因的轉(zhuǎn)錄。加入誘導(dǎo)物，使其與阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。第22頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、微生物與基因工程工具酶基因工程所用的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化獲得的。

對(duì)DNA片段進(jìn)行操作，必須要有能“切短”DNA的得心應(yīng)手的工具。工具酶就是對(duì)不同來源的DNA片段進(jìn)行切割拼接組裝。在分離目的基因或切割載體時(shí)，需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行準(zhǔn)確切割。在構(gòu)建重組DNA時(shí)，需要DNA連接酶催化，使目的DNA片段與載體DNA進(jìn)行連接。第23頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）或簡(jiǎn)稱為限制性酶（restrictionenzyme）是指能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶.其作用是在分離目的基因或切割載體時(shí)對(duì)DNA進(jìn)行準(zhǔn)確切割。如：大腸桿菌的EcoRⅠ，流感嗜血桿菌的HindⅢ，肺炎克雷伯氏桿菌的KpnⅠ等等。EcoRⅠ中E是大腸桿菌屬名的第一個(gè)字母，co是種名的頭兩個(gè)字母，R是株名，Ⅰ表示該菌第一個(gè)被分離出來的酶。第24頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的作用

第25頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三同裂酶：有些來源不同的限制酶卻識(shí)別和切割相同的序列，這類限制酶稱為同裂酶。

同尾酶：有些來源不同的限制酶，識(shí)別和切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。

第26頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三將不同的DNA片段連接在一起的酶叫DNA連接酶。DNA連接酶主要來自T4噬菌體和大腸桿菌。DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA中單鏈切口的封閉，也能催化兩個(gè)雙鏈DNA片段進(jìn)行連接。2、DNA連接酶第27頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA連接酶主要有兩種：一種是T4DNA連接酶：T4DNA連接酶由一條多肽鏈組成，相對(duì)分子量為6800Da，通常催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率為高。催化反應(yīng)需要Mg2+和ATP，ATP作為反應(yīng)的能量來源。T4DNA連接酶在基因工程操作中被廣泛應(yīng)用。另一種是大腸桿菌DNA連接酶：大腸桿菌DNA連接酶的相對(duì)分子量為7500Da，連接反應(yīng)的能量來源是NAD+，此酶催化DNA連接反應(yīng)與T4DNA連接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端連接。第28頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三體外DNA連接方法目前常用的三種：（1）用T4或E.coliDNA連接酶可連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；（2）用T4DNA連接酶連接具有平末端DNA片段；（3）先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再進(jìn)行連接。第29頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、

微生物作為克隆載體的宿主為了保證外源基因在細(xì)胞中的大量擴(kuò)增和表達(dá)，必須選擇合適的克隆載體宿主。一個(gè)理想的克隆載體宿主。第30頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三宿主基本要求是：

①

能夠高效吸收外源DNA；

②

具有使外源DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；

③

不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；

④

一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；

⑤

便于進(jìn)行基因操作和篩選；

⑥具有安全性。第31頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三

原核生物的大腸桿菌及真核生物的釀酒酵母，由于他們具有生長(zhǎng)迅速、極易培養(yǎng)，能在廉價(jià)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)背景十分清楚等突出優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的重要克隆載體宿主。另外還有枯草桿菌和昆蟲細(xì)胞系等。

第32頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二節(jié)基因工程的基本過程基因工程操作主要步驟為：①分離或合成基因（切），②通過體外重組將基因插入載體（接），③將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞（轉(zhuǎn)），④擴(kuò)增克隆基因（增），⑤篩選重組體克隆（檢），⑥對(duì)克隆的基因進(jìn)行鑒定或測(cè)序，⑦控制外源基因的表達(dá)，⑧得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物、工程菌（利用基因工程技術(shù)獲得的具有新功能的微生物稱為工程菌）。第33頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三第34頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三第35頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、目的基因的分離或合成1，從基因文庫(kù)中篩選基因文庫(kù)是指生物染色體基因組各DNA片斷的克隆總體（即某一特定生物體全基因組的克隆集合）。人們可以根據(jù)目的基因的性質(zhì)和序列從中篩選。第36頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三2，cDNA法目的DNA可用反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板來合成。（以該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再洗脫下編碼該蛋白質(zhì)的特異mRNA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因克隆。）cDNA文庫(kù)是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫(kù)中的每一個(gè)克隆只含一種mRNA信息。根據(jù)目的基因的特性可從中篩選。第37頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三3，化學(xué)合成法如果目的基因的全序列是已知的，則可以利用化學(xué)合成法直接合成。2kb的基因序列。第38頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、體外重組目的基因用酶切下來，同時(shí)打開載體DNA分子，然后將兩者連接成雜合分子。第39頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。重組DNA人工導(dǎo)入受體細(xì)胞有許多方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、受體細(xì)胞的電穿孔和顯微注射等等。第40頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三1，外源DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如果外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；如果外源DNA被構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌體質(zhì)粒，則可通過轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入細(xì)胞。第41頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）λ噬菌體的體外包裝和感染如果外源DNA被包裝成λ噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機(jī)制導(dǎo)入細(xì)胞。體外包裝是將重組DNA分子與噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，從而組裝成完整的具有感染力的λ噬菌體粒子。第42頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三2，外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞重組DNA以轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體。（2）外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞微量注射和電穿孔法為主，還有磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法、聚陽離子轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法等等。

第43頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞有微量注射、電穿孔法、共培養(yǎng)法、葉片培養(yǎng)法、基因槍法等等。第44頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三共培養(yǎng)法：共培養(yǎng)法是指將含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。葉片培養(yǎng)法是指含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物葉片共培養(yǎng)?；驑尫ㄊ抢梦棸驯砻嫖接型庠碊NA的金屬微粒高速射進(jìn)植物的細(xì)胞、組織或幼苗。第45頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增是指受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后立即進(jìn)行短時(shí)間的培養(yǎng)。如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞壁再生等。第46頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、轉(zhuǎn)化子的篩選和重組子的鑒定在制備目的基因時(shí)對(duì)染色體進(jìn)行了切割，產(chǎn)生大量的DNA小片斷，故進(jìn)入受體細(xì)胞的克隆不僅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所獲得的是含有不同克隆子的細(xì)胞群體。在DNA體外重組中，外源DNA片斷與載體DNA的連接反應(yīng)物一般不經(jīng)分離直接用于轉(zhuǎn)化，第47頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三

由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到100%的理想極限，因此必須使用各種篩選與鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子（接納載體或重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與非轉(zhuǎn)化子，重組子（含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子）與非重組子（僅含有空載載體的轉(zhuǎn)化子），以及期望重組子（含有目的基因的重組子）與非期望重組子（不含有目的基因的重組子）。第48頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三方法：將轉(zhuǎn)化擴(kuò)增物稀釋一定的倍數(shù)后，均勻涂布在用于篩選的特殊培養(yǎng)基上，使之長(zhǎng)出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克?。?。然后進(jìn)行新一輪的篩選鑒定。第49頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、載體遺傳標(biāo)記法（重組體表型特征的鑒定）原理是利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子或重組子。第50頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑴抗藥性篩選（抗生素平板法）

⑵營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選

⑶顯性模型篩選

⑷噬菌斑法

⑸探針重組篩選第51頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑴抗生素平板法：如果外源DNA片段插入載體的位點(diǎn)位于抗生素基因之外，將轉(zhuǎn)化的重組體細(xì)胞置于含有該抗生素的培養(yǎng)基平板上，仍可長(zhǎng)成菌落。第52頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑵插入失活性：是一種因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象。如，pBR322質(zhì)粒上具有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），已知有24種主要的限制酶在pBR322上都只有一個(gè)切點(diǎn)，其中有7種限制酶的切點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因之內(nèi)，3種限制酶的切點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因（Ampr）之內(nèi)，外源DNA片段插入這些位點(diǎn)之中的任一位點(diǎn)將導(dǎo)致相應(yīng)的抗性基因失活。第53頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三第54頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑶插入表達(dá)法：在某些載體的標(biāo)記基因前面連接一段負(fù)控制序列，當(dāng)外源DNA片段插入該負(fù)控制序列中，使負(fù)控制序列失活，因而位于下游的標(biāo)記基因因解除阻遏而得到表達(dá)。第55頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑷β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法：許多大腸桿菌的載體質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ/標(biāo)記基因，它包括大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列以及氨基端146個(gè)氨基酸殘基的編碼序列，其表達(dá)產(chǎn)物是無活性的不完全酶，稱為α受體；而許多大腸桿菌的受體細(xì)胞在染色體DNA上含有β-半乳糖苷酶羧基端的部分編碼序列，由其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也無活性，但可作為α供體。第56頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三

受體和供體一旦結(jié)合，便可恢復(fù)β-半乳糖苷酶的活性，將5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）底物水解成籃色產(chǎn)物。當(dāng)外源DNA片段插入到位于lacZ/標(biāo)記基因內(nèi)部的多克隆位點(diǎn)上時(shí)，生長(zhǎng)在含有X-gal的平板上的重組子因lacZ/基因的滅活而成白色，非重組子則顯藍(lán)色。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）——誘導(dǎo)物。第57頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定⑴菌落或噬菌斑原位雜交法又稱探針原位雜交法，前提條件是必須擁有與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列。根據(jù)核酸雜交的原理，探針序列特異地雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團(tuán)進(jìn)行定位檢測(cè)。第58頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三方法步驟：醋酸纖維素濾膜覆蓋在菌落上，用針扎不對(duì)稱的三個(gè)孔（標(biāo)記），37OC培養(yǎng)1-2h→濾膜NaOH裂解細(xì)菌→中性緩沖液中和NaOH→清洗緩沖液浸泡3min洗去菌體碎片和蛋白→晾干后800C下干燥1~2h固定DNA單鏈→高溫高離子強(qiáng)度下（降低本底）與探針雜交→稍低離子濃度溶液清洗膜三遍（除去未特異雜交的探針），晾干→X-光膠片暗箱內(nèi)曝光。根據(jù)膠片上感光點(diǎn)的位置，在原始平板上挑取相應(yīng)菌落。第59頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑵內(nèi)切酶圖譜鑒定在外源DNA片斷大小以及限制性酶切圖譜已知的情況下，對(duì)重組子進(jìn)行酶切鑒定，不僅能區(qū)分重組分子與非重組分子，有時(shí)還能初步確定期望重組子與非期望重組子。第60頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三

將初步篩選的陽性克隆即轉(zhuǎn)化子小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)?；蛘咧亟M噬菌體的DNA。用內(nèi)切酶酶切，然后進(jìn)行電泳。檢測(cè)插入DNA片段大小。分子量大于載體質(zhì)粒的為重組子，最終利用載體上的已知酶切位點(diǎn)，建立重組質(zhì)粒插入片段的酶切圖譜，并與已知數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，進(jìn)而確定期望重組子。第61頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三①全酶解法：用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切開質(zhì)粒DNA上所有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，形成全酶切圖譜。第62頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三②部分酶解法：通過限制酶量或限制反應(yīng)的時(shí)間使酶切位點(diǎn)發(fā)生切割反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的部分限制性片段，顯然這些片段大于全酶片段，因此能確定同種酶多個(gè)切點(diǎn)的準(zhǔn)確位置。第63頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三③重組子快速搜尋法：（EcoRI-HindⅢ聯(lián)合酶切→BamHI酶切→PstI酶切）。第64頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑶

PCR鑒定用與插入片段兩側(cè)互補(bǔ)序列作為引物，以重組質(zhì)粒DNA作為模板，進(jìn)行PCR分析，可快速測(cè)出插入DNA片段大小及鑒定其序列特異性。第65頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三⑷DNA序列測(cè)定為了確證目的基因序列的正確性，必須對(duì)重組的DNA進(jìn)行序列測(cè)定。（以便最終獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列，精確界定基因的邊界）第66頁(yè)，講稿共76頁(yè)，2023年5月2日，星期三

a.DNA的化學(xué)降解測(cè)序法b.DNA的雙脫氧末端