噬菌體展示系統(tǒng)課件

第二章噬菌體的相關(guān)技術(shù)一、噬菌體的侵染過程：1.吸附2.侵入3.增殖4.成熟（裝配）5.釋放

1.吸附：當(dāng)噬菌體與其相應(yīng)的特異宿主在水環(huán)境中發(fā)生偶然碰撞后，如果尾絲尖端與宿主細(xì)胞表面的特異性受體（蛋白質(zhì)、多糖或者脂蛋白-多糖復(fù)合物等）接觸后，就可觸發(fā)頸須把卷緊的尾絲散開，隨即就附著在受體上，從而把刺突、基板固著于細(xì)胞表面。

吸附作用受許多外來因素的影響，如噬菌體的數(shù)量，陽離子濃度，溫度和輔助因子（色氨酸、生物素等）2.侵入：吸附后尾絲收縮，基板從尾絲中獲得一個(gè)構(gòu)象刺激，促使尾鞘中的144個(gè)蛋白質(zhì)亞基發(fā)生復(fù)雜的移位，并緊縮成原長(zhǎng)的一半，由此把尾管推出并插入細(xì)胞壁和膜中。此時(shí)尾管端所攜帶的少量溶菌酶可把細(xì)胞壁上的肽聚糖水解，以利侵入。頭部的核酸迅速即通過尾管及其末端小孔注入宿主細(xì)胞中，并將蛋白質(zhì)軀殼留在壁外。從吸附到侵入的時(shí)間極短，例如T4只需15s。3.增殖：包括核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的生物合成。首先，噬菌體一起核算中的遺傳信息向宿主細(xì)胞發(fā)出指令并提供“藍(lán)圖”，使宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)按嚴(yán)密程序、有條不紊地逐一轉(zhuǎn)向或適度改造，從而轉(zhuǎn)變成能有效合成噬菌體所特有的組分和“部件”，其中所需“原料”可通過宿主細(xì)胞原有核酸等的降解、代謝庫內(nèi)的貯存物或從外界環(huán)境中取得。一旦大批成套的“部件”已合成，就在細(xì)胞“工廠”里進(jìn)行突擊裝配，于是就產(chǎn)生了一大群形狀、大小完全相同的子代噬菌體。4.成熟（裝配）：噬菌體的成熟過程事實(shí)上就是把已合成的各種“部件”進(jìn)行自裝配的過程。在T4噬菌體的裝配過程中，約需30種不同蛋白質(zhì)和至少47個(gè)基因參與，其裝配過程主要步驟有：DNA分子的縮合，通過衣殼包裹DNA而形成完整的頭部，尾絲和尾部的其他“部件”獨(dú)立裝配完成，頭部和尾部相結(jié)合后，最后再裝上尾絲。5.裂解：當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)的大量子代噬菌體成熟后，由于水解細(xì)胞膜的脂肪酶和水解細(xì)胞壁的溶菌酶等的作用，促進(jìn)了細(xì)胞的裂解，從而完成子代噬菌體的釋放。

噬菌體侵染過程如下：噬菌體的侵染過程示意圖：噬菌體的侵染實(shí)驗(yàn)的研究證明了DNA是遺傳物質(zhì)

二、噬菌體展示及抗體庫技術(shù)（一）噬菌體展示技術(shù)：1.展示技術(shù)的發(fā)展歷程1985年,Smith第一次成功

地將EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶基

因插入絲狀噬菌體基因pⅢ

中,并在噬菌體表面表達(dá)出了

融合的蛋白。1990年McCafferty等又在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了庫容為106的抗體庫,并從中成功地篩選出了溶菌酶單鏈抗體后,噬菌體抗體庫技術(shù)成為了抗體工程中的一種新興的抗體制備的手段。近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,利用基因工程手段獲得基因工程抗體的方法成為抗體技術(shù)研究的熱點(diǎn).2.噬菌體展示技術(shù)的簡(jiǎn)介：

是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí),外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。

3.噬菌體展示技術(shù)的原理：

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。

肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。4.噬菌體展示系統(tǒng)：

單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)：

（1）PⅢ展示系統(tǒng):絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)～5個(gè)拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT3個(gè)功能區(qū)域，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。

其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。（2）PⅧ及其他展示系統(tǒng)：PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2700個(gè)左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。

此外，尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統(tǒng)的研究報(bào)道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點(diǎn)，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能。從所掌握的文獻(xiàn)來看，該系統(tǒng)主要用于cDNA表面展示文庫的構(gòu)建，并取得了不錯(cuò)的篩選效果。λ噬菌體展示系統(tǒng)：

（1）PV展示系統(tǒng)：λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由6個(gè)PV亞基組成。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。目前，用PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。（2）D蛋白展示系統(tǒng)：D蛋白的分子質(zhì)量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。

病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對(duì)于展示那些可以對(duì)噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。T4噬菌體展示系統(tǒng)：T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。

吳健敏等成功地將大小約215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。令人值得關(guān)注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在DNA包裝被抑制時(shí)，T4是雙股DNA噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時(shí)組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。T7噬菌體展示系統(tǒng)：

T7噬菌體是烈性噬菌體。具有兩個(gè)雙鏈臂,外源基因可插入雙臂間,經(jīng)體外包裝后可直接侵染大腸桿菌,獲得抗體庫,目前應(yīng)用也較為廣泛。T7噬菌體的優(yōu)點(diǎn)：1.生長(zhǎng)迅速。2.可表達(dá)大于50個(gè)氨基酸的多肽片段而不需要輔助噬菌體進(jìn)行包裝。3.可高拷貝地表達(dá)約50個(gè)氨基酸的多肽片段或低拷貝地表達(dá)1000個(gè)氨基酸的多肽片段。4.在高PH值，高鹽、變性劑等條件下十分穩(wěn)定，有利于根據(jù)不同需要采用多種條件進(jìn)行篩選，而不影響噬菌體本身活性。5.噬菌體展示技術(shù)的局限性：（1）在噬菌體展示過程中必須經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數(shù)量一般限制在109。（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗(yàn)中，由于部分未折疊的蛋白在細(xì)菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達(dá)差，也是體內(nèi)選擇壓力的一個(gè)例子。真核細(xì)胞蛋白在細(xì)菌中表達(dá)差是因?yàn)樗鼈兊牡鞍踪|(zhì)合成與折疊機(jī)制不同的緣故。（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。（4）由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對(duì)細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示。（二）噬菌體抗體庫技術(shù)：1.簡(jiǎn)介：

噬菌體抗體庫技術(shù)是指利用分子生物學(xué)手段將外源DNA片段插入噬菌體基因,與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相連接,通過侵染宿主,在噬菌體表面表達(dá)成融合蛋白的過程經(jīng)過對(duì)目標(biāo)分子如蛋白、糖蛋白、病毒及小分子物質(zhì)等的特異性結(jié)合篩選過程,從而富集得到針對(duì)的目標(biāo)分子的噬菌體展示抗體的技術(shù)。2.噬菌體抗體庫的分類

(1)根據(jù)免疫抗體庫

插入基因片段非免疫抗體庫天然抗體庫的來源半合成抗體庫全合成抗體庫

(2)根據(jù)可利用的載體主要分為:絲狀噬菌體展示（M13為最常用）

λ噬菌體展示T4噬菌體展示T7噬菌體展示具體內(nèi)容如下：①絲狀噬菌體是一種分泌型噬菌體。是單鏈環(huán)狀DNA病毒，其含有五種結(jié)構(gòu)蛋白：

主要衣殼蛋白p8

4種次要衣殼蛋白p3、p6、p7和P9。②絲狀噬菌體展示外源性基因，有兩種形式：

噬菌體載體噬菌粒載體3.目標(biāo)抗體的篩選：

工程抗體的體外成熟對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域具有重要的作用,通過噬菌體抗體庫的篩選是抗體體外成熟的其中一種方式,通過不斷地篩選,從而促使陽性克隆不斷地富集。

最常見的篩選方法包括固相篩選、生物素篩選和液相篩選等。Burmester等構(gòu)建了青霉素免疫單鏈抗體庫,并利用免疫試管包被transferrin-EMCS-ampicillin進(jìn)行抗體的篩選。Yuan等從7個(gè)不同的人種,共47個(gè)健康人類的血液中提取基因,構(gòu)建了人源天然scFv噬菌體抗體庫,并利用細(xì)胞篩選的方法獲得anti-MISIIR單鏈抗體分子。4.目標(biāo)抗體的表達(dá)：

外源基因的克隆表達(dá)主要有兩種途徑,即原核表達(dá)及真核表達(dá),原核表達(dá)主要是通過大腸桿菌進(jìn)行表達(dá),真核表達(dá)主要是通過酵母菌進(jìn)行表達(dá),如畢赤酵母菌;噬菌體展示抗體的表達(dá)多是通過各種不同的E.coil菌種進(jìn)行表達(dá),如HB2151、pMF3、pHOG-21。5.噬菌體抗體庫的應(yīng)用：

噬菌體展示抗體的應(yīng)用已逐漸深入抗體工程的多個(gè)領(lǐng)域如醫(yī)療制藥、基于ELISA技術(shù)的食品和環(huán)境的安全檢測(cè)及蛋白質(zhì)相互作用等。①在醫(yī)療制藥方面的研究應(yīng)用：

對(duì)老年癡呆癥、狂犬病、抗腫瘤藥物載體、SARS、HIV、肝炎、結(jié)核病等疾病方面都有很大的幫助。②在食品環(huán)境檢測(cè)中的研究應(yīng)用：Zhao等利用噬菌體抗體庫成功篩選得到了低分子量環(huán)境毒素-微囊藻毒素的目標(biāo)抗體,為環(huán)境中小分子毒素的研究提供了新的途徑。Li等以pCANTAB5E為噬菌體載體,構(gòu)建了甲胺磷的小鼠免疫抗體庫,利用ELISA的方法篩得了三個(gè)陽性克隆并進(jìn)行了可溶性表達(dá)。Brichta等利用天然噬菌體抗體庫對(duì)2,4-D除草劑進(jìn)行了篩選研究。③在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方面的研究應(yīng)用：Smith等利用噬菌體抗體庫技術(shù)獲得4-乙酰氨基苯酚的親和肽,對(duì)低分子量蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了相應(yīng)的研究,為傳感器的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

孔波等利用pHEN1-KM13噬菌體展示系統(tǒng)表達(dá)