污染的產(chǎn)生及防治

關(guān)于污染的產(chǎn)生及防治第1頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三PCR實(shí)驗(yàn)室污染的特點(diǎn)概念：由于各種原因，造成的PCR擴(kuò)增體系中出現(xiàn)了非目的檢測(cè)樣本本身的模板，使得PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性。PCR實(shí)驗(yàn)室的污染不同于一般生物安全實(shí)驗(yàn)室的污染PCR污染總是產(chǎn)生假陽性結(jié)果第2頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三PCR流程樣品準(zhǔn)備（samplepreparation）反應(yīng)體系配置（PCRreactionassembly）PCR反應(yīng)（PCRexecution）反應(yīng)后分析（post-PCRanalysis）第3頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三PCR污染的途徑操作錯(cuò)誤或者誤差造成的樣品間交差污染PCR試劑的污染PCR實(shí)驗(yàn)器材的污染氣溶膠（AmpliconAerosol）第4頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三PCR污染的四種來源標(biāo)本或模板間的交叉污染PCR試劑的污染PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染實(shí)驗(yàn)室克隆質(zhì)粒的污染第5頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三引起PCR污染的原因標(biāo)本或模板間交叉污染容器被污染標(biāo)本或模板放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染模板吸取過程中,因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染第6頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三引起PCR污染的原因PCR試劑污染PCR試劑配制過程中,移液器、容器、水及其他溶液等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。第7頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為10^13拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限。極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可形成假陽性。移液器吸取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，同一支移液器去準(zhǔn)備PCRmixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染：據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為0.001μm~1000μm的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系。

空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠第8頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三引起PCR污染的原因?qū)嶒?yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量濃度高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力.其污染可能性也很大第9頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三PCR污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.PCR強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測(cè)的敏感性經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對(duì)定量造成很大的問題NTC(NoTemplateControl):必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對(duì)照反應(yīng)。

第10頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三對(duì)照試驗(yàn)1.陽性對(duì)照:它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大，操作時(shí)需注意防止交叉污染。2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照，它包括①陰性標(biāo)本對(duì)照（NTC）:被檢的標(biāo)本是血清，就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑空白對(duì)照（Blank）:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。3.重復(fù)性試驗(yàn)4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

第11頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。主要涉及：（1）劃分操作區(qū)（2）分裝試劑（3）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)第12頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三劃分操作區(qū)－－理想的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)第13頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－分裝試劑PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA。無污染的試驗(yàn)器材無污染的消耗品PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

第14頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

1.在準(zhǔn)備樣品時(shí)，著清潔的工作服和手套，切忌著已污染過PCR產(chǎn)物的工作服和手套；

2.戴一次性手套，發(fā)現(xiàn)手套有污染時(shí)應(yīng)立即更換手套；實(shí)驗(yàn)完成后離開所工作場(chǎng)所時(shí)，脫掉手套，放置在專用垃圾桶中；

3.使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

4.準(zhǔn)備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起；第15頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

5.開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；所有含質(zhì)粒模板和PCR產(chǎn)物的EP管開蓋前高速離心1-3分鐘；6.最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；7.操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；

8.由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；

第16頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

9.禁止把PCR產(chǎn)物帶到配制PCR體系的場(chǎng)所；禁止在配制PCR體系的場(chǎng)所操作質(zhì)粒和含克隆質(zhì)粒的菌液；

10.在從有蓋的容器中取樣時(shí)，把蓋子拿在手中，或者確保它放到清潔和不會(huì)污染周圍環(huán)境的地方。

11.盡量保證反應(yīng)體系和試劑在一個(gè)密封的容器中；

12.PCR反應(yīng)完成后，盡量減少打開密封反應(yīng)體系的機(jī)會(huì)；如必須打開，應(yīng)在獨(dú)立專用房間內(nèi)打開；

13.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后或定期清潔工作臺(tái)面和儀器。

第17頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－移液器操作移液器操作由于操作時(shí)不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣時(shí)要十分小心。1）準(zhǔn)備PCR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準(zhǔn)備PCR過程中使用濾芯槍頭第18頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三污染的預(yù)防－－首要原則永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC對(duì)照如果不能在污染出現(xiàn)的第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時(shí)間的數(shù)據(jù)不可信準(zhǔn)備PCR的移液器要專用

千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備PCR體系第19頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三追蹤污染源－－設(shè)立陰陽性對(duì)照有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。第20頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三追蹤污染源－－環(huán)境污染在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：

1.加樣器；

2.電泳裝置；

3.切膠用刀或手術(shù)刀片；

4.離心機(jī)；

5.冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；

6.氣溶膠。第21頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三選用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶Uracil-N-Glycosylase)的試劑，有助于防止PCR產(chǎn)物引起的污染。UNG：50攝氏度，2分鐘，作用于含有dU的DNA雙鏈或單鏈然后開始PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟，同時(shí)UNG失活使用UNG酶控制污染對(duì)于不含dU的PCR產(chǎn)物無效污染處理－－反應(yīng)液污染第22頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三問題：－－PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，該方法效率越高，小于100bp的產(chǎn)物，效果不很完全；－－影響PCR擴(kuò)增效率；－－UNG酶的活性保存非常重要；－－UNG酶的造價(jià)不低，每一檢測(cè)人份的費(fèi)用上升比較明顯。