核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題

關(guān)于核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題第1頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃

時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。第2頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法第3頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法第4頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三

SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取緩沖液第5頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：第6頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹(shù)脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。第7頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因組DNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物第8頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。第9頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液第10頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒DNA－煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。第11頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。第12頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第13頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第14頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）第15頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁第16頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取第17頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理第18頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化第19頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌第20頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取第21頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ叩?2頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題二：DNA降解。對(duì)策

原因第23頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題三：DNA提取量少。對(duì)策

原因第24頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第25頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三RNA提取的通用方法異硫氰酸胍/苯酚法

原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。RNA提取的通用方法第26頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三異硫氰酸胍/苯酚法

步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。RNA提取的通用方法第27頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響RNA提取的因素

材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，－70℃短期保存影響RNA提取的因素第28頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響RNA提取的因素

樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量影響RNA提取的因素第29頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三

純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素第30頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第31頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題RNA的降解

OD260/OD280

比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳第32頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三RNA降解

新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。第33頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三RNA降解

冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。第34頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三OD260/OD280

比值偏低

蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第35頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三OD260/OD280

比值偏低

抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。第36頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三電泳帶型異常

非變性電泳：上樣量超過(guò)

3ug，電壓超過(guò)

6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致

28S和

18S條帶分不開(kāi)。

變性電泳條帶變淡：

EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。第37頁(yè)，講稿共42頁(yè)，2023年5月2日，星期三下游實(shí)驗(yàn)效果不佳

RNA降解

抽提試劑的殘留

75%乙醇洗滌

樣品中雜質(zhì)的殘留

多糖等雜質(zhì)，再次沉淀

DNA污染

使用RNase-Free的DNa