內(nèi)皮抑素的低分子肝素修飾及對(duì)兔角膜新生血管的抑制作用

內(nèi)皮抑素的低分子肝素修飾及對(duì)兔角膜新生血管的抑制作用【摘要】目的探討利用低分子肝素對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并評(píng)價(jià)其對(duì)角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)的抑制作用。方法采用化學(xué)方法用低分子肝素修飾內(nèi)皮抑素，堿燒傷法建立兔角膜新生血管模型，分別在球結(jié)膜下注射低分子肝素化內(nèi)皮抑素、內(nèi)皮抑素和生理鹽水，觀察新生血管的生長情況。結(jié)果成功的利用低分子肝素對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Ⅰ組新生血管的長度、面積、數(shù)量、VEGF的表達(dá)均明顯低于其它兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論低分子肝素化內(nèi)皮抑素可有效抑制角膜新生血管的生長，效果優(yōu)于內(nèi)皮抑素。

【關(guān)鍵詞】低分子肝素內(nèi)皮抑素修飾角膜新生血管兔

itsangiogenesiseffectsonrabbitcorneas

Abstract:ObjectiveToinvestigatethemodificationofendostatin(ES)withlowmolecularweightheparin(LMEH)anditsinhibitoryeffectsoncornealneovascularization.MethodsESwasmodifiedwithLMWHbyachemicalmethod.TherabbitCNVmodelwasmadewithalkaliburning.LMWHES(group1)，ES(group2)andnormalsaline(controlgroup)weresubconjunctivallyinjected.ResultsThebloodvesselwasshorterandsmalleringroup1thanintheothertwogroups()andtheexpressionofVEGFingroup1wasalsosignificantlylowerthanthatoftheothertwogroups().ConclusionsLMWHEScaneffectivelyinhibitthegrowthofCNVandissuperiortoES.

Keywords:Lowmolecularweightheparin;Endostatin;Modification;Cornea;Neovascularization;Rabbit

找一種效果更佳的內(nèi)皮抑素修飾物。

1資料與方法

材料含內(nèi)皮抑素基因的重組表達(dá)載體工程菌；LMWH；健康成年新西蘭白兔30只，體重?kg，雌雄兼有，眼部無異常。

方法

LMWH對(duì)ES的化學(xué)修飾采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，按照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)，分離純化后得到電泳單點(diǎn)純的內(nèi)皮抑素。采用高碘酸氧化法活化LMWH，制得LMWH活化液，于pH、?mol/L的NaCO-NaHCO3緩沖液中對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行化學(xué)修飾。通過SDSPAGE電泳監(jiān)測(cè)修飾反應(yīng)過程，比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率。測(cè)定ES及LMWHES在25?℃和37?℃水浴中的熱穩(wěn)定性。

LMWHES及ES對(duì)兔角膜堿燒傷后新生血管抑制作用的觀察30只兔用氯胺酮及氯丙嗪誘導(dǎo)全麻，將浸潤1?min的1?mol/L氫氧化鈉濾紙片置于兔右眼角膜中央30?s，然后立即用20?mlBBS沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊1?min建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

隨機(jī)將兔分為3組，每組10只。堿燒傷后第一天，分別在球結(jié)膜下注射50?μg/mlLMWHES、50?μg/ml內(nèi)皮抑素和生理鹽水各?ml，以后隔日注射1次，共8次。每天行裂隙燈顯微鏡觀察球結(jié)膜、角膜有無充血、水腫及全身狀況。并于術(shù)后第4、7、10、13天用雙腳規(guī)測(cè)量CNV長度，并用數(shù)碼相機(jī)定位拍攝CNV生長狀態(tài)，將其輸入計(jì)算機(jī)使用軟件ImageProPlus進(jìn)行圖像分析。

堿燒傷后16天用空氣栓塞法處死動(dòng)物，無菌下取帶2?mm寬鞏膜的角膜組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，進(jìn)行HE染色和SP免疫組化分析。染色結(jié)果判斷：細(xì)胞漿黃色為+，棕色為，棕黑色為；結(jié)果分析：采用日本產(chǎn)LUZEXF圖像分析儀，以灰度值表示VEGF的含量。微血管數(shù)量觀察：取上述免疫組化切片，每只眼選3張，每張切片任選5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野下CNV橫斷面數(shù)目。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)，以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分指標(biāo)行相關(guān)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)運(yùn)算采用統(tǒng)計(jì)軟件包。

2結(jié)果

LMWH對(duì)ES的化學(xué)修飾采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的內(nèi)皮抑素分子量約為20?KD，純度達(dá)98%以上。通過SDSPAGE電泳監(jiān)測(cè)修飾反應(yīng)過程，比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率以及比較電泳監(jiān)測(cè)結(jié)果確定LMWH修飾ES的時(shí)間為48?h。對(duì)分離純化后的LMWHES進(jìn)行SDSPAGE電泳鑒定，結(jié)果顯示純化后的LMWHES在30?kD左右出現(xiàn)一條單一條帶，見彩圖6。

ES和LMWHES在25?℃和37?℃時(shí)的穩(wěn)定性比較及活性保留百分率：37?℃時(shí)穩(wěn)定性大小為LMWHESES，保溫60?min后活性保留百分率：LMWHES、ES；25?℃時(shí)穩(wěn)定性大小為LMWHESES，保溫60?min后活性保留百分率:LMWHES、ES?！菊磕康奶接懤玫头肿痈嗡貙?duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并評(píng)價(jià)其對(duì)角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)的抑制作用。方法采用化學(xué)方法用低分子肝素修飾內(nèi)皮抑素，堿燒傷法建立兔角膜新生血管模型，分別在球結(jié)膜下注射低分子肝素化內(nèi)皮抑素、內(nèi)皮抑素和生理鹽水，觀察新生血管的生長情況。結(jié)果成功的利用低分子肝素對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Ⅰ組新生血管的長度、面積、數(shù)量、VEGF的表達(dá)均明顯低于其它兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論低分子肝素化內(nèi)皮抑素可有效抑制角膜新生血管的生長，效果優(yōu)于內(nèi)皮抑素。

【關(guān)鍵詞】低分子肝素內(nèi)皮抑素修飾角膜新生血管兔

itsangiogenesiseffectsonrabbitcorneas

Abstract:ObjectiveToinvestigatethemodificationofendostatin(ES)withlowmolecularweightheparin(LMEH)anditsinhibitoryeffectsoncornealneovascularization.MethodsESwasmodifiedwithLMWHbyachemicalmethod.TherabbitCNVmodelwasmadewithalkaliburning.LMWHES(group1)，ES(group2)andnormalsaline(controlgroup)weresubconjunctivallyinjected.ResultsThebloodvesselwasshorterandsmalleringroup1thanintheothertwogroups()andtheexpressionofVEGFingroup1wasalsosignificantlylowerthanthatoftheothertwogroups().ConclusionsLMWHEScaneffectivelyinhibitthegrowthofCNVandissuperiortoES.

Keywords:Lowmolecularweightheparin;Endostatin;Modification;Cornea;Neovascularization;Rabbit

找一種效果更佳的內(nèi)皮抑素修飾物。

1資料與方法

材料含內(nèi)皮抑素基因的重組表達(dá)載體工程菌；LMWH；健康成年新西蘭白兔30只，體重?kg，雌雄兼有，眼部無異常。

方法

LMWH對(duì)ES的化學(xué)修飾采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，按照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)，分離純化后得到電泳單點(diǎn)純的內(nèi)皮抑素。采用高碘酸氧化法活化LMWH，制得LMWH活化液，于pH、?mol/L的NaCO-NaHCO3緩沖液中對(duì)內(nèi)皮抑素進(jìn)行化學(xué)修飾。通過SDSPAGE電泳監(jiān)測(cè)修飾反應(yīng)過程，比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率。測(cè)定ES及LMWHES在25?℃和37?℃水浴中的熱穩(wěn)定性。

LMWHES及ES對(duì)兔角膜堿燒傷后新生血管抑制作用的觀察30只兔用氯胺酮及氯丙嗪誘導(dǎo)全麻，將浸潤1?min的1?mol/L氫氧化鈉濾紙片置于兔右眼角膜中央30?s，然后立即用20?mlBBS沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊1?min建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

隨機(jī)將兔分為3組，每組10只。堿燒傷后第一天，分別在球結(jié)膜下注射50?μg/mlLMWHES、50?μg/ml內(nèi)皮抑素和生理鹽水各?ml，以后隔日注射1次，共8次。每天行裂隙燈顯微鏡觀察球結(jié)膜、角膜有無充血、水腫及全身狀況。并于術(shù)后第4、7、10、13天用雙腳規(guī)測(cè)量CNV長度，并用數(shù)碼相機(jī)定位拍攝CNV生長狀態(tài)，將其輸入計(jì)算機(jī)使用軟件ImageProPlus進(jìn)行圖像分析。

堿燒傷后16天用空氣栓塞法處死動(dòng)物，無菌下取帶2?mm寬鞏膜的角膜組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，進(jìn)行HE染色和SP免疫組化分析。染色結(jié)果判斷：細(xì)胞漿黃色為+，棕色為，棕黑色為；結(jié)果分析：采用日本產(chǎn)LUZEXF圖像分析儀，以灰度值表示VEGF的含量。微血管數(shù)量觀察：取上述免疫組化切片，每只眼選3張，每張切片任選5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野下CNV橫斷面數(shù)目。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)，以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分指標(biāo)行相關(guān)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)運(yùn)算采用統(tǒng)計(jì)軟件包。

2結(jié)果

LMWH對(duì)ES的化學(xué)修飾采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的內(nèi)皮抑素分子量約為20?KD，純度達(dá)98%以上。通過SDSPAGE電泳監(jiān)測(cè)修飾反應(yīng)過程，比較不同時(shí)間點(diǎn)修飾液的自由氨基修飾率、活性保留百分率