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關(guān)于電化學(xué)分離法第1頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三§6-1電泳分離法一、電泳分離法的原理二、電泳分離法的分類三、高效毛細(xì)管電泳四、電泳分離法的應(yīng)用第2頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理
在電解質(zhì)溶液中,位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象,稱之為電泳。
由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同,遷移速率不同,可實(shí)現(xiàn)分離。第3頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理
1937年,Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間,兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳,第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白;
發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定;第一次的自由溶液電泳;第一臺(tái)電泳儀;
1948年,獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng);第4頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第5頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理
當(dāng)帶電離子以速度ν
在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí),受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。電場(chǎng)力:FE=qE
阻力:F=fν故:qE=fνq—離子所帶的有效電荷;
E—電場(chǎng)強(qiáng)度;ν—離子在電場(chǎng)中的遷移速度;
f—平動(dòng)摩擦系數(shù)(對(duì)于球形離子:f=6πηr;r—離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑;η—介質(zhì)的粘度;)第6頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理所以,遷移速度:(球形離子)
物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度(遷移率)μ
:?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。
(6-1)第7頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理另外,根據(jù)離子遷移率的定義,μ也可以寫成:
式中,V是外加電壓,L是兩電極間的距離,t是電泳的時(shí)間,s是帶電質(zhì)點(diǎn)在時(shí)間t內(nèi)遷移的距離。根據(jù)上式,兩種粒子遷移距離之差為:(6-3)(6-2)第8頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理影響帶電粒子分離程度的因素1)帶電粒子遷移率(淌度)根據(jù)(6-3)式,兩種粒子的淌度差越大,分離越好。而根據(jù)(6-1)式可知:帶電粒子的淌度與電荷成正比,與離子半徑成反比。
所以,電荷與半徑相差越大,越容易用電泳法分離。第9頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理2)電解質(zhì)溶液的組成據(jù)(6-1)式,溶液組成不同,粘度不同,導(dǎo)致遷移率不同。另外,電解質(zhì)組成不同,有時(shí)會(huì)改變測(cè)定物的電荷及半徑,從而導(dǎo)致遷移率不同。第10頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理3)外加電位梯度電位梯度是指每厘米的平均電位降,即V/L,當(dāng)L一定時(shí),加在兩電極間的電壓越高,分離所需的時(shí)間越短,分離越完全。對(duì)于分離性質(zhì)相近的元素,多半使用高壓電泳,其電位梯度達(dá)100V/cm以上,但高電場(chǎng)會(huì)產(chǎn)生焦耳熱,使柱效降低。第11頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、電泳分離法的原理4)電泳時(shí)間電泳時(shí)間越長(zhǎng),離子分離越完全。但分離性質(zhì)相似的元素,單靠增加電泳時(shí)間收效不大。第12頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、電泳分離法的分類
電泳分為前流型和區(qū)帶型。前流型是指無(wú)支持體的溶液自由進(jìn)行的,而區(qū)帶型是指在一個(gè)支持體上進(jìn)行的電泳。后者應(yīng)用最廣。
按形狀分類:U型管電泳、柱狀電泳、板電泳;按載體分類:濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳(即前流型)、毛細(xì)管等;
傳統(tǒng)電泳分析:操作煩瑣,分離效率低,定量困難,無(wú)法與其他分析相比。第13頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、高效毛細(xì)管電泳1.高效毛細(xì)管電泳的發(fā)展與特點(diǎn)2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論3.高效毛細(xì)管電泳的儀器4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式第14頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三
1981年,Jorgenson和Luckas,用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析,柱效高達(dá)4×105/m理論塔板數(shù),促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革,迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細(xì)管電泳。1.高效毛細(xì)管電泳的發(fā)展與特點(diǎn)高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn):
一是采用了20-75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管;二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。第15頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三1.高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1)儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化
電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2)分析速度快、分離效率高
在3.1min內(nèi)分離36種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子,4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子;分離柱效:105~107/m理論塔板數(shù);
第16頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三1.高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)3)操作方便、消耗少
進(jìn)樣量極少,水介質(zhì)中進(jìn)行;4)應(yīng)用范圍極廣
有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子;生物大分子等;分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等;
第17頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論1)電滲流現(xiàn)象
當(dāng)固體與液體接觸時(shí),固體表面由于某種原因帶一種電荷,則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷,在液-固界面形成雙電層,二者之間存在電位差。第18頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論
當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí),就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng),這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。
電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流(electroosmoticflow,簡(jiǎn)稱EOF)。
第19頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論
石英毛細(xì)管,柱內(nèi)充液pH>3時(shí),表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷,形成雙電層。
在高電場(chǎng)的作用下,帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng),由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的,故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng),速度ν電滲流。第20頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論
電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示,取決于電滲淌度μ和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即
ν電滲流
=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢(shì),即
μ=ε0εζ/ηε0—真空介電常數(shù);ε—介電常數(shù);ζ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢(shì)。
ν電滲流
=ε0εζ
E/η2)HPCE中電滲流的大小第21頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論實(shí)際電泳分析,可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后,按下式計(jì)算
ν電滲流
=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長(zhǎng)度;teo—電滲流標(biāo)記物(中性物質(zhì))的遷移時(shí)間。第22頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論
電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì):內(nèi)表面帶負(fù)電荷,溶液帶正電荷,電滲流流向陰極;內(nèi)表面帶正電荷,溶液帶負(fù)電荷,電滲流流向陽(yáng)極;
石英毛細(xì)管;帶負(fù)電荷,電滲流流向陰極;3)HPCE中電滲流的方向第23頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論改變電滲流方向的方法:(1)毛細(xì)管改性表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán);(2)加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑,將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷,溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。第24頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論4)HPCE中電滲流的流形
電荷均勻分布,整體移動(dòng),電滲流的流動(dòng)為平流,塞式流動(dòng)(譜帶展寬很?。?;液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流,拋物線流型,管壁處流速為零,管中心處的速度為平均速度的2倍(引起譜帶展寬較大)。第25頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論5)HPCE中電滲流的作用
電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5~7倍;
各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為:
ν+=ν電滲流
+ν+ef陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致;
ν-=ν電滲流
-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反;
ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致;(1)可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離;(2)改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性,如同改變LC中的流速;(3)電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性;在HPCE中,控制電滲流非常重要。第26頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第27頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第28頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三
電滲在電泳分離中扮演著重要角色,是伴隨電泳產(chǎn)生的一種電動(dòng)現(xiàn)象。多數(shù)情況下,電滲流速度是電泳速度的5-7倍。
因此,在HPCE中利用電滲流可將正、負(fù)離子和中性分子一起朝一個(gè)方向產(chǎn)生差速遷移,在一次HPCE操作中同時(shí)完成正、負(fù)離子的分離測(cè)定。
由于電滲流的大小和方向可以影響HPCE分離的效率、選擇性和分離度,所以成為優(yōu)化分離條件的重要參數(shù)。電滲流的細(xì)小變化將嚴(yán)重影響HPCE分離的重現(xiàn)性(遷移時(shí)間和峰面積)。所以,電滲流的控制是HPCE中的一項(xiàng)重要任務(wù)。第29頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論6)HPCE中影響電滲流的因素i)電場(chǎng)強(qiáng)度的影響
電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比,當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí),電滲流速度正比于工作電壓。ii)毛細(xì)管材料的影響
不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同,產(chǎn)生的電滲流大小不同;第30頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論iii)溶液pH的影響
對(duì)于石英毛細(xì)管,溶液pH增高時(shí),表面電離多,電荷密度增加,管壁zeta電勢(shì)增大,電滲流增大,pH=7,達(dá)到最大;pH<3,完全被氫離子中和,表面電中性,電滲流為零。
分析時(shí),采用緩沖溶液來(lái)保持pH穩(wěn)定。第31頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第32頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第33頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethene,一般稱作“不粘涂層”;是一種使用了氟取代聚乙烯中所有氫原子的人工合成高分子材料。
這種材料具有抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑的特點(diǎn),幾乎不溶于所有的溶劑。同時(shí),聚四氟乙烯具有耐高溫的特點(diǎn),它的摩擦系數(shù)極低,所以可作潤(rùn)滑作用之余,亦成為了水管內(nèi)層的理想涂料。第34頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論ⅳ)陰離子的影響
在其他條件相同,濃度相同而陰離子不同時(shí),毛細(xì)管中的電流有較大差別,產(chǎn)生的焦耳熱不同。
第35頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三第36頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論
毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高,使溶液的黏度下降,電滲流增大。溫度變化來(lái)自于“焦耳熱”;
焦耳熱:毛細(xì)管溶液中有電流通過(guò)時(shí),產(chǎn)生的熱量;
HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。溫度每變化1,將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%~3%;ⅴ)溫度的影響第37頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論ⅵ)添加劑的影響
加入濃度較大的中性鹽,如K2SO4,溶液離子強(qiáng)度增大,使溶液的黏度增大,電滲流減小。
加入表面活性劑,可改變電滲流的大小和方向;如:加入陰離子表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉(SDS),可以使壁表面負(fù)電荷增加,zeta電勢(shì)增大,電滲流增大;加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈,使電滲流增大。第38頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.高效毛細(xì)管電泳的基本理論第39頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器第40頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器第41頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器第42頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器
電壓:0~30kV;分離柱不涂敷任何固定液;紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器;(可檢測(cè)到:10-19~10-21mol/L)第43頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器1)高壓電源
0~30
kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源;具有恒壓、恒流、恒功率輸出;電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng);電壓穩(wěn)定性:0.1%;電源極性易轉(zhuǎn)換;2)毛細(xì)管柱
材料:石英:各項(xiàng)性能好;玻璃:光學(xué)、機(jī)械性能差;規(guī)格:內(nèi)徑20~75μm,外徑350~400μm;長(zhǎng)度<=1m第44頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三3.高效毛細(xì)管電泳的儀器3)緩沖液池
化學(xué)惰性,機(jī)械穩(wěn)定性好;4)檢測(cè)器要求:具有極高靈敏度,可柱端檢測(cè);檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化;
類型檢測(cè)限/mol
特點(diǎn)紫外-可見10-13~10-15
加二極管陣列,光譜信息熒光10-15~10-17靈敏度高,樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18~10-20靈敏度極高,樣品需衍生電導(dǎo)10-14~10-16離子靈敏,需專用的裝置第45頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式八種分離類型,介紹常用的幾種;根據(jù)試樣性質(zhì)不同,采用不同的分離類型;每種機(jī)理的選擇性不同;第46頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式1)毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)
帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。
正離子:兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致,在負(fù)極最先流出;中性粒子:無(wú)電泳現(xiàn)象,受電滲流影響,在陽(yáng)離子后流出;第47頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式
陰離子:兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反;ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。
最基本、應(yīng)用廣的分離模式;第48頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式2)毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)
將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性,類似分子篩的作用,試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散,所得峰型尖銳,分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān),CZE模式很難分離,采用CGE能獲得良好分離,DAN排序的重要手段。
第49頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式特點(diǎn):抗對(duì)流性好,散熱性好,分離度極高。無(wú)膠篩分技術(shù):采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。第50頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式3)膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)?。┚彌_溶液中加入離子型表面活性劑,其濃度達(dá)到臨界濃度,形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下,膠束在柱中移動(dòng)。
ⅱ)電泳流和電滲流的方向相反,且ν電滲流
>ν電泳,負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng);第51頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式
ⅲ)中性分子在膠束相和溶液(水相)間分配,疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢,流出時(shí)間長(zhǎng);ⅳ)可用來(lái)分離中性物質(zhì),擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍;ⅴ)色譜與電泳分離模式的結(jié)合。第52頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式4)毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)
?。└鶕?jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù);
ⅱ)毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)(合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物),當(dāng)施加直流電壓(6~8V)時(shí),管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度;
ⅲ)氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān),在酸性溶液中帶正電荷,反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí),呈電中性,淌度為零;第53頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式4)毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)ⅳ)聚焦:具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移,分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí),呈電中性,停止移動(dòng),形成窄溶質(zhì)帶而相互分離;ⅴ)陽(yáng)極端裝稀磷酸溶液,陰極端裝稀NaOH溶液;ⅵ)加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過(guò)檢測(cè)器檢測(cè);ⅶ)電滲流在CIEF中不利,應(yīng)消除或減小。第54頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式
?。煞N淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子,試樣離子的淌度全部位于兩者之間,并以同一速度移動(dòng)。
ⅱ)負(fù)離子分析時(shí),前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽(yáng)極前進(jìn),逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣,陽(yáng)極檢測(cè)。5)毛細(xì)管等速電泳(CITP)第55頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.高效毛細(xì)管電泳的分離模式
ⅲ)不同離子的淌度不同,所形成區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度不同(ν=μE),淌度大的離子區(qū)帶電場(chǎng)強(qiáng)度小;沿出口到進(jìn)口,將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場(chǎng)強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號(hào)中離子擴(kuò)散到“3”號(hào),該區(qū)電場(chǎng)強(qiáng)度大,離子被加速,返回到“2”區(qū);當(dāng)“2”號(hào)中離子跑到“1”號(hào)區(qū),離子被減速使之歸隊(duì);ⅳ)特點(diǎn):界面明顯,富集、濃縮作用;第56頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、電泳分離法的應(yīng)用1.離子分析analysisofion2.藥物分析analysisofpharmaceutics3.手性化合物分析analysisofchiralcompounds4.氨基酸分析analysisofaminoacids5.核酸分析及DNA測(cè)序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA6.新進(jìn)展及熱點(diǎn)問題advancesandspecialtopics第57頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三1.離子的分析陽(yáng)離子分析遷移方向和電滲流方向一致;
4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子;陽(yáng)極進(jìn)樣,陰極檢測(cè);具有很高的靈敏度;第58頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三1.離子的分析
陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近,分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低;質(zhì)量小、電荷密度大的離子如:SO4-2、Cl-、F-等,電泳速率大于電滲流,陽(yáng)極端流出,在陰極端無(wú)法檢測(cè);加入電滲流改性劑,十六烷基三甲基溴化胺等,使電泳方向和電滲流方向一致,可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子;陰極進(jìn)樣,陽(yáng)極檢測(cè);離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析;第59頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三2.藥物分析
檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析;尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段;采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式,在11min內(nèi)分離17種藥物;第60頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三采用MEKC(膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜)模式,鑒定違禁藥物;效果優(yōu)于HPLC法第61頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三
合成獲得單一手性化合物相當(dāng)困難;528種手性合成藥物,61中以單一對(duì)映體形式銷售,其他為外消旋體;檢測(cè)分析也相當(dāng)困難;研究熱點(diǎn);R-反應(yīng)停是安眠藥,S-式致胎兒畸形;
HPCE分離分析手性化合物的方法:加入手性選擇劑;形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)有差異,結(jié)合HPCE的高效率;常用手性選擇劑:環(huán)糊精及其衍生物;手性冠醚;手性表面活性劑(氨基酸衍生物、膽酸鈉、?;敲撗跄懰峒捌溻c鹽、低聚糖等天然手性表面活性劑)3.手性化合物分析第62頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三4.氨基酸和蛋白質(zhì)分析采用MEKC模式,在25分鐘內(nèi)分離了23種丹?;被幔籋PCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀;第63頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三蛋白質(zhì)分析第64頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三5.核酸分析和DNA排序重要分析手段;圖,酶解的雙螺旋DNA限制性片段的分離;第65頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三1)微型化
整體化學(xué)分析系統(tǒng)(TAS)及TAS微型化在硅片上光刻出矩形槽作為毛細(xì)管,理論塔板數(shù)105/m;2)聯(lián)用儀器
CE-MS;3)陣列毛細(xì)管凝膠電泳
應(yīng)用于人類基因DNA測(cè)序;
5~10萬(wàn)個(gè)基因,30億個(gè)堿基對(duì),目前最有效的DNA序列分析儀,10小時(shí)/次;可同時(shí)電泳24個(gè)樣品;速度1200堿基對(duì)/小時(shí),提高速度!
100支毛細(xì)管陣列電泳;速度280堿基對(duì)/小時(shí)/支6.新進(jìn)展第66頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三§6-2化學(xué)修飾電極分離法一、概述二、化學(xué)修飾電極的分類三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用第67頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、概述
1973年,Lane和Hubbard開辟了改變電極表面結(jié)構(gòu)以控制電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程的新概念,指示了化學(xué)修飾電極的萌芽。
1975年,Miller和Murray分別報(bào)道了電極表面進(jìn)行化學(xué)修飾的研究,標(biāo)志著化學(xué)修飾電極正式問世。第68頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三一、概述
通過(guò)共價(jià)鍵合、吸附、聚合等手段有目的的將具有功能性(如催化、配合、電色、光電)的物質(zhì)引入電極表面,使電極賦予新的、特定功能的過(guò)程稱為電極的化學(xué)修飾,所得到的電極稱為化學(xué)修飾電極。廣義上的修飾電極也包括通過(guò)物理方法制備的修飾電極?!净瘜W(xué)修飾電極】第69頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、化學(xué)修飾電極的分類1.吸附型:通過(guò)吸附的方式將修飾物質(zhì)結(jié)合在電極表面的方式,可以制備單分子層和多分子層。★平衡吸附型:修飾物質(zhì)在電極表面形成熱力學(xué)吸附平衡。方法簡(jiǎn)單、直接,但修飾物質(zhì)有限,應(yīng)用較少。
★靜電吸附型:離子通過(guò)靜電引力在電極表面集聚,形成多分子層。
★
LB膜型:不溶于水的表面活性物質(zhì)在水面上形成排列有序的單分子膜(Langmuir-Blodgett,LB膜)。
★
SA膜:通過(guò)分子的自組裝作用在固體電極表面形成有序的單分子膜(selfassembling,SA膜)。
★涂層型:將功能性物質(zhì)涂布在電極表面形成的薄膜。第70頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、化學(xué)修飾電極的分類吸附修飾電極的制備
單層吸附膜復(fù)合膜化學(xué)吸附法:是利用固體/溶液界面間的自然吸附現(xiàn)象來(lái)制備單分子層修飾電極的簡(jiǎn)便方法,具有簡(jiǎn)單,直接的優(yōu)點(diǎn)。第71頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、化學(xué)修飾電極的分類LB膜:不溶于水的表面活性物質(zhì)在水面上形成排列有序的單分子膜,(LB膜)。SA膜:基于分子的自組作用,在固體表面形成高度有序的單分子膜,自組裝膜(selfassembl-ing,SA膜)。
SA膜法能獲得可控制的和均一的粗糙度的表面,表面具有很好的耐久力和穩(wěn)定性,比LB膜法更加簡(jiǎn)單易行。優(yōu)點(diǎn)第72頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三
納米金自組裝電極的制備方法裸金電極
預(yù)處理
cysteine沖洗浸泡納米金
4oC下保存第73頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、化學(xué)修飾電極的分類2、共價(jià)鍵合型:在電極的表面通過(guò)鍵合反應(yīng)把預(yù)定功能團(tuán)接在電極表面。常用基體電極有碳電極、金屬和金屬氧化物電極
第74頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三二、化學(xué)修飾電極的分類3、聚合物型:利用聚合反應(yīng)在電極表面形成修飾膜的電極。制備方式有氧化還原沉積、有機(jī)硅烷縮合、等離子聚合、電化學(xué)聚合等。4、其他類型:無(wú)機(jī)物修飾電極,如普魯士藍(lán)修飾電極;粘土修飾電極;沸石修飾電極;金屬及金屬氧化物修飾電極。第75頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征1.電極的預(yù)處理
由于在固體電極上電化學(xué)行為的重現(xiàn)性差,在修飾前必須對(duì)電極表面進(jìn)行清潔處理。固體電極重現(xiàn)性差的主要原因:固體表面狀態(tài)差異金屬和碳材料的表面具有一定的表面能,這種表面能的分布不均勻。晶面上存在的缺陷,如臺(tái)階、紐結(jié)、位錯(cuò)和吸附原子等,使溶液中的許多物質(zhì)很容易吸附到這些具有高能的位點(diǎn)上而造成污染。同時(shí)金屬和碳的表面都能被化學(xué)的或電化學(xué)的方法氧化,氧化作用的同時(shí)也增加了表面粗糙度,容易形成惰化層。第76頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征2.清潔電極表面的方法:1)機(jī)械研磨,拋光至鏡面。當(dāng)電極表面存在惰化層和很強(qiáng)的吸附層時(shí)必須用機(jī)械或加熱的辦法處理。
拋光電極的材料:金剛砂,CeO2,ZrO2,MgO,α-Al2O3粉等。拋光時(shí)按粒徑降低的順序進(jìn)行研磨。拋光后移入超聲水浴中清洗,直至干凈。第77頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征2)化學(xué)法和電化學(xué)法處理化學(xué)的和電化學(xué)的處理,是最常用來(lái)清潔,活化電極表面的手段。電化學(xué)法常用強(qiáng)的礦物酸或中性電解質(zhì)溶液,有時(shí)也用配位作用弱的緩沖溶液在恒電位,恒電流或循環(huán)電位掃描下極化,可獲得氧化的、還原的或干凈的電極表面。2.清潔電極表面的方法:第78頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征
鑒定電極表面是否清潔的方法對(duì)于碳電極,采用觀測(cè)Fe(CN)63-在中性電解質(zhì)水溶液中的伏安曲線的方法。在1×10-3mol/L的K3Fe(CN)6磷酸鹽緩沖溶液中掃描,直到出現(xiàn)可逆的陰極和陽(yáng)極峰。對(duì)于鉑電極,在稀硫酸中進(jìn)行循環(huán)電位掃描,觀察氫和氧的電化學(xué)行為,即出現(xiàn)了氫和氧的各自的吸附和氧化峰就表示表面已清潔。第79頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三金電極表面清潔的鑒定
對(duì)于金電極,在稀硫酸中進(jìn)行循環(huán)電位掃描,觀察其氧化與還原峰電位。直到其氧化和還原峰完全重合,即表示電極表面已清潔。第80頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三三、化學(xué)修飾電極的電極處理和表征3.化學(xué)修飾電極的表征:
電化學(xué)法:循環(huán)伏安法、計(jì)時(shí)電流法、計(jì)時(shí)電位法、計(jì)時(shí)庫(kù)侖法、脈沖伏安法、交流阻抗法光譜電化學(xué)法:紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜、偏振光譜、紫外可見光譜、圓二色譜波譜法能譜法顯微學(xué)法:掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、掃描隧道顯微鏡(STM)、掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)石英晶體微天平法第81頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三SEM:
利用二次電子信號(hào)成像來(lái)觀察樣品的表觀形態(tài)。(利用極狹窄的電子束去掃描樣品,通過(guò)電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生的各種效應(yīng)來(lái)進(jìn)行表觀分析)第82頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三裸金電極和納米金自組裝金電極的SEM照片裸金電極16nm金修飾金電極第83頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三STM:頭部為單個(gè)原子的極細(xì)的針尖去接近樣品表面,當(dāng)針尖與樣品表面很近(<1nm)時(shí),針尖頭部的原子與樣品表面原子的電子云發(fā)生重疊,此時(shí)若在針尖和樣品之間加一個(gè)偏壓,電子便會(huì)穿過(guò)針尖和樣品之間的勢(shì)壘而形成納安級(jí)的隧道電流。AFM:通過(guò)檢測(cè)樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。第84頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三納米金自組裝金電極的AFM第85頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三電子自旋共振(ESR)是專門用于研究含有未成對(duì)電子物質(zhì)的波譜技術(shù)。把它應(yīng)用于修飾電極可以推斷形成的自由基結(jié)構(gòu)。表面分析能譜法用于研究修飾表面的微觀結(jié)構(gòu)、組成和狀態(tài)。常用的能譜有X射線光電子能譜(XPS),俄歇電子能譜(AES),二次離子質(zhì)譜等。第86頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三石英晶體微天平是一種具有10-9g數(shù)量級(jí)測(cè)量質(zhì)量變化能力的特別靈敏的檢測(cè)器。可用于測(cè)量固體電極表面層中質(zhì)量、電流和電量隨電位的變化關(guān)系。從而認(rèn)識(shí)電化學(xué)的界面過(guò)程,膜內(nèi)物質(zhì)傳輸,膜生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和膜內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)等。石英晶體微天平(QuartzCrystalMicrobalance-QCM)的發(fā)展始于上世紀(jì)60年代初期,它是一種非常靈敏的質(zhì)量檢測(cè)儀器,其測(cè)量精度可達(dá)納克級(jí),比靈敏度在微克級(jí)的電子微天平高100倍,理論上可以測(cè)到的質(zhì)量變化相當(dāng)于單分子層或原子層的幾分之一。石英晶體微天平利用了石英晶體諧振器的壓電特性,將石英晶振電極表面質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號(hào)的頻率變化,進(jìn)而通過(guò)計(jì)算機(jī)等其他輔助設(shè)備獲得高精度的數(shù)據(jù)第87頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用可利用電催化反應(yīng)以提高測(cè)定的選擇性和靈敏性。如聚乙烯二茂鐵修飾膜可催化氧化抗壞血酸??衫秒x子交換反應(yīng)進(jìn)行選擇性富集。如用Nafion/GC電極可選擇交換多巴胺等,而抗壞血酸和尿酸不干擾測(cè)定。多巴胺由腦內(nèi)分泌,可影響一個(gè)人的情緒。ArvidCarlsson確定多巴胺為腦內(nèi)信息傳遞者的角色使他贏得了2000年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。多巴胺是一種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì),用來(lái)幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)。這種腦內(nèi)分泌主要負(fù)責(zé)大腦的情欲,感覺,將興奮及開心的信息傳遞,也與上癮有關(guān)。第88頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用可利用表面配合反應(yīng)進(jìn)行富集分離,在電極表面修飾上配合劑和鰲合劑,使待測(cè)離子與之發(fā)生配合反應(yīng)而被選擇分離。第89頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用1、電化學(xué)傳感器一般是利用修飾膜的選擇透過(guò)性修飾電極的離子篩效應(yīng)以及催化特性(如修飾酶的催化作用)?,F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于pH傳感器、電位傳感器、電流傳感器、離子敏感電子器件、生物物質(zhì)和藥物等的傳感電極中。其中pH傳感器研究最多,一些含羥基、N原子的芳香化合物聚合到電極表面后都具有pH響應(yīng)功能,尤以苯胺及衍生物為最。第90頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用2、在伏安分析、電位溶出中的應(yīng)用當(dāng)修飾劑選擇具有配合富集能力的有機(jī)物或聚合物時(shí),修飾電極便可用于溶出伏安法或電位溶出法中的工作電極,可大大提高富集能力。電極表面的活性基團(tuán)與溶液中的待測(cè)物有四種相互作用:1)離子交換作用;2)絡(luò)合作用;3)離子交換-絡(luò)合協(xié)同作用;4)選擇性吸附。可使被測(cè)物選擇性分離、富集,大大提高了分析的靈敏度。除無(wú)機(jī)物外,一些電活性有機(jī)物也可以富集測(cè)定,如左旋多巴、甲氨喋呤、多巴胺、抗壞血酸等。
第91頁(yè),講稿共104頁(yè),2023年5月2日,星期三四、化學(xué)修飾電極分離法的應(yīng)用3、電催化
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