目的基因的克隆與分離

關(guān)于目的基因的克隆與分離第1頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第五講目的基因的克隆與分離目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。第2頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一節(jié)基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切第3頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點(diǎn)2.缺點(diǎn)目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene第4頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、隨機(jī)片斷化1.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開(kāi)。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。（1）限制性內(nèi)切酶的選用原則第5頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3A—BamHI）第6頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.機(jī)械切割法（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷。第7頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動(dòng)化合成法。第8頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三①保護(hù)dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或堿的脫保護(hù)（1）原理1.磷酸二酯法②帶保護(hù)的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進(jìn)行。帶5’保護(hù)的單核苷酸與帶3’保護(hù)的另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來(lái)。第9頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）合成過(guò)程下一個(gè)5’端保護(hù)的單核苷酸又可以同3’端保護(hù)的二核苷酸聚合。第10頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2.磷酸三酯法第11頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三將第一個(gè)核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸連接處有三個(gè)酯鍵！第12頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三固相磷酸三酯合成過(guò)程固相支持物結(jié)果是全保護(hù)的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對(duì)氯苯。最后脫保護(hù)固相支持物固相支持物C第13頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。二、化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段的5’端帶上磷酸。1.互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）第14頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈第15頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.互補(bǔ)延伸連接法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物第16頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA3.合成探針序列4.定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低第17頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第18頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫(kù)。一、基因文庫(kù)的構(gòu)建1.基因文庫(kù)（genelibrary）第三節(jié)目的基因的保存與文庫(kù)構(gòu)建第19頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）目前常用的載體2.構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb第20頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷。②酶切法：第21頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。第22頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾第23頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第24頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）第25頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第26頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。第27頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。第28頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）第29頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第30頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第31頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿第32頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成第33頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第34頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第35頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來(lái)合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第36頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第37頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第38頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第39頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第40頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三6.cDNA文庫(kù)的大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n第41頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、文庫(kù)的查詢（screening）用目的基因探針與文庫(kù)中的重組載體進(jìn)行Southernblot雜交。文庫(kù)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析第42頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)目的基因的分離和擴(kuò)增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來(lái)分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第43頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過(guò)柱與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR第44頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）第45頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的組織mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。第46頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過(guò)柱吸收RNA-DNA單鏈濾過(guò)羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫(kù)第47頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR原理：利用幾乎所有mRNA3’的polyA尾巴合成polyT的錨定引物

，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的第一鏈，然后加入隨機(jī)引物合成第二鏈，得到與mRNA對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽，變性膠電泳，比較不同來(lái)源的cDNA帶，有差異的基因進(jìn)一步克隆。（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’第48頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’第49頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）5’端的隨機(jī)引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’擴(kuò)增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二鏈，并PCR第50頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（4）隨機(jī)引物與錨定引物成對(duì)擴(kuò)增12種錨定引物，若與20種隨機(jī)引物，可組成240組引物。引物組合：240組能分出20000多條帶！實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNA，20000mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的mRNA。在測(cè)序膠上，每組擴(kuò)出50-100條長(zhǎng)度為100-500bp的帶。第51頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（5）隨機(jī)-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。選擇有差異的帶，進(jìn)一步PCR作探針。篩選文庫(kù)，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。第52頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、PCR擴(kuò)增獲得目的基因1.直接從基因組中擴(kuò)增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴(kuò)增原核生物基因。第53頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增第54頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2.從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。第55頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA第56頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三克隆外源基因第57頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞基因的重組與轉(zhuǎn)移第58頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第59頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第五節(jié)DNA片段的體外連接第60頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第61頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端第62頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第63頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三ligasenick第64頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’第65頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)第66頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來(lái)不能把插入片段再切下來(lái)。非酶切位點(diǎn)第67頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第68頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三

第69頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三

第70頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來(lái)。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：第71頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用第72頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接第73頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第74頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接第75頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-第76頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。第77頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第78頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三引物1GCAGAATTC

互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’第79頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列-5’3’-引物2第80頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！第81頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3’端人為地各加一個(gè)T利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！第82頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第83頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。第84頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。第85頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.DNA插入的方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第86頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.插入基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第87頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷第88頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）第89頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第90頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第六節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第91頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種第92頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三第93頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第94頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第95頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。第96頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法electronporation第97頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第98頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第99頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過(guò)夜第100頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第101頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三①生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下。③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化。融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)

第102頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過(guò)受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第103頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃-45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。第104頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃-45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃第105頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）互補(bǔ)型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2第106頁(yè)，講稿共121頁(yè)，2023年5月2日，星期三(5)體外包裝過(guò)