血清蛋白質(zhì)濃度定量測定

BCA法定量蛋白質(zhì)濃度BCA法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。操作簡便，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確，試劑穩(wěn)定性好，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，抗干擾能力強(qiáng)【原理】：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。

【原理】：基本原理BCA(bicinchoninicacid)法蛋白濃度定量：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+（biuretreaction）。BCA與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度?！驹噭?、試劑A：分別稱取10gBCA二鈉鹽、20g無水碳酸鈉、0.16g酒石酸鈉、4g氫氧化鈉、9.5g碳酸氫鈉，混合調(diào)PH值至11.25，加水至1L。2、試劑B：4％硫酸銅。3、BCA工作液：試劑A100ml＋試劑B2ml混合。操作步驟1.先將solutionA搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積solutionA加1體積solutionB試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻。BCA工作液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2、樸蛋白餐質(zhì)標(biāo)奸準(zhǔn)液筒：用結(jié)山晶牛侮血清顧白蛋俱白(B渠SA脊)根據(jù)葡其純型度用生厭理鹽餡水配媽制成1.烈5m仰g/優(yōu)ml的蛋奏白質(zhì)消標(biāo)準(zhǔn)眨液。（訴純度竟可經(jīng)貫凱氏逃定氮釀法測甩定蛋筐白質(zhì)烏含量嚴(yán)而確時(shí)定）3.繪制賴標(biāo)準(zhǔn)肅曲線啦：取6支試匪管，龜編號蝴后分隆別加脖入0m稼L、0.積02使mL、0.沿04耗mL、0.淹06說mL、0.初08骨mL、0.苗1m顧L標(biāo)準(zhǔn)樣蛋白注質(zhì)溶推液(B拳SA嬌)，然廳后各披管分恒別用姓去離釣子水更補(bǔ)充零到0.件1m蔑L(fēng)，最細(xì)后各疲試管堡中分卡別加爬入2.紹0m遙LB胳CA工作兵液，每加城完一傅管，立即在漩仆渦混址合器陜上混合（注意廈不要什太劇禮烈，舅以免紙產(chǎn)生絲式大量宵氣泡廢而難費(fèi)于消渣除），欣以蛋忍白質(zhì)諷的蛋邪白含青量為草橫坐殖標(biāo)、嘆吸光牧度A為縱獨(dú)坐標(biāo)夫繪制最標(biāo)準(zhǔn)洞曲線久。4.樣品拉測定責(zé)：同繪涼制標(biāo)納準(zhǔn)曲證線方桐法，頭在一慢支試底管中詢加入踐待測險(xiǎn)樣品0.趕1m燈L代替練標(biāo)準(zhǔn)服蛋白董質(zhì)溶蓄液，竟然后附加入2.屬0m紙LB播CA工作穴液后悟，立坑即在椒漩渦鎖混合姐器上沾混合菜，測室吸光溪度A，查秋標(biāo)準(zhǔn)約曲線誘，求脫出待篩測樣碎品中突蛋白零質(zhì)濃虎度（g/專L）?！緝?yōu)缺蘿點(diǎn)】(一)操作若簡單罷，快疲速，45分鐘愈內(nèi)完緊成測張定，撕比經(jīng)檔典的Lo夜wa紋ry法快4倍且從更加盜方便玻；(二)準(zhǔn)確皇靈敏愚，試毅劑穩(wěn)技定性謙好，BC撐A試劑混的蛋社白質(zhì)鉆測定斬范圍場是20日-2風(fēng)00拌μg肯/m洪l，微腹量BC促A測定致范圍極在0.生5-蜻10肺μg邀/m走l。(三)經(jīng)濟(jì)膊實(shí)用窩，除且試管迫外，絕測定漏可在桶微板曠孔中度就進(jìn)過行，亞大大祖節(jié)約垃樣品糕和試系劑用夜量；(四)抗試餅劑干痛擾能絡(luò)力比池較強(qiáng)赤，如茶去垢袖劑，接尿素類等均書無影照響此法輔測定扔蛋白崖質(zhì)濃列度，遲近些坐年被赤科研孫工作蘭者廣催泛選奇用。川目前BC憶A法的試劑姓盒市面閑有售帖。BC罰A蛋白吸濃度華測定試劑腔盒(B赴CA返P身ro搖te平in精A塘ss般ay叫K區(qū)it眉)是根討據(jù)目鬼前世攝界上行最常長用蛋敘白濃媽度檢嘩測方迎法之籮一BC墊A法研礎(chǔ)制而嗚成，慣實(shí)現(xiàn)場了蛋村白濃獻(xiàn)度測怨定的涌簡單閑，高前穩(wěn)定戚性，似高靈急敏度摟和高臉兼容學(xué)性。檢測西濃度態(tài)下限就達(dá)到25微克/毫升牽，最置小檢侮測蛋基白量虜達(dá)到0.饑5微克窗，待胸測樣里品體來積為1～20微升蘋。試劑睜盒組剩成2.稀釋網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)況品：毯完全患溶解消蛋白方質(zhì)標(biāo)尤準(zhǔn)品破（5m奶g/午ml冠BS庸A(牛血滔清白名蛋白),-短20℃保存騰）取10微升魚用PB利S(p街H7絮.4的等幫滲磷塊酸鹽膛緩沖扔液)稀釋系至10菊0微升（樣玻品一與般可皆用PB厚S稀釋約），使終述濃度禮為0.效5m茄g/銹ml。將稀抹釋后初的標(biāo)肥準(zhǔn)品由（0.仁5m經(jīng)g/畫ml）按0,爸2囑,稠4，6，8,啄1材2,食1灣6,理2表0微升呢分別鵲加到96孔板珍的蛋倉白標(biāo)禮準(zhǔn)品鴿孔中孕，加挎標(biāo)準(zhǔn)微品稀撇釋液眉補(bǔ)足喚到20微升宴。體積(ul)02468121620終濃度（ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5pH革7.純4的等慶滲磷輔酸鹽招緩沖陶液（PB采S）的偵配制pH串7.毀4的等麻滲磷倘酸鹽就緩沖液（0.紋01幸mo怒l/幕L，pH勉7.澡4,易PB音S）:Na蔥CI8.精0gKH2PO40.貓2gNa2HP闊O4·12華H2O2.留9gKC嫂I0.次2g將上戚列試炸劑按過次序?qū)尤敫舛客ㄈ萜髹`中，友加適廈量蒸每餾水旁溶解奏后，秋再定加容至10因00許mL，調(diào)pH值至7.袍4,高壓堪消毒泳滅菌11顆2K封pa盼20竄mi值n，冷維卻后坡，保裂存于4℃冰依箱中父備用蒙。6孔板弄底面涉積9.蛙6c添m2,加培緩養(yǎng)液蝦的量2.渡5m塌l,12孔板善底面捎積4.協(xié)5c民m2,加培音養(yǎng)液出的量2m噸l,24孔板仇底面?zhèn)畏e2c思m2,加培假養(yǎng)液殘的量1m譯l,96孔板腎底面淡積0.裕32丹cm2,加培割養(yǎng)液愁的量0.離1m羅l,摘自叼司徒毒鎮(zhèn)強(qiáng)醫(yī)的《細(xì)胞急培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3、歪待測穿樣品盡：用安雙縮暢脲測攻定法面的樣塵品稀艱釋而例成。此法跑測定泛蛋白底質(zhì)濃舒度，棟近些文年被擋科研圍工作鞏者廣浮泛選搏用。餡目前BC健A法的試劑貓盒市面計(jì)有售積?？傊停m湯然蛋皇白質(zhì)霧含量立的測鴿定方祖法很賽多，翼但是僚，還勾沒有加一個(gè)細(xì)完美惜的方此法。賓在選溪擇測艙定方憲法時(shí)粒，可公根據(jù)明實(shí)驗(yàn)拼要求與和實(shí)貧驗(yàn)室箱條件蜘決定鏈?！驹噭?、酸試劑A：1％BC五A二鈉兩鹽2％無酸水碳獲酸鈉0.前16踐%酒石惹酸鈉0.混4％氫潛氧化街鈉0.餃95％碳覽酸氫槐鈉混合足調(diào)PH值至11結(jié).2跪5。2、梅試劑B：4％硫賢酸銅選。3、BC福A工作辯液：丟試劑A效10載0m才l＋遞試劑B丹2m簡l混合前。4、杏蛋白促質(zhì)標(biāo)貨準(zhǔn)液音：用贏結(jié)晶糟牛血忌清白太蛋白敵根據(jù)吉其純桌度用漂生理海鹽水掀配制高成1.碌5m關(guān)g/蜘ml的蛋屑白質(zhì)犯標(biāo)準(zhǔn)匠液。地（純豪度可就經(jīng)凱瓣氏定領(lǐng)氮法挨測定暈蛋白悅質(zhì)含問量而藍(lán)確定年）5、濁待測六樣品壇：用工雙縮正脲測壁定法訓(xùn)的樣吊品稀支釋而婚成。此法郵測定角蛋白欄質(zhì)濃擔(dān)度，彎近些廣年被磨科研怠工作餅者廣叛泛選忠用。出目前BC先A法的攤試劑兄盒市糕面有糾售?？傊s，雖銹然蛋叛白質(zhì)摧含量巨的測震定方用法很呼多，留但是藍(lán)，還帖沒有度一個(gè)帖完美劈燕的方昂法。廉在選烤擇測融定方隔法時(shí)招，可愿根據(jù)紙實(shí)驗(yàn)館要求愛和實(shí)室驗(yàn)室局條件梅決定因。實(shí)驗(yàn)步驟加適季當(dāng)體資積樣布品到96孔板納的樣全品孔糞中，習(xí)加標(biāo)紙準(zhǔn)品墻稀釋明液不紀(jì)足道20耕ul。即：診將蛋仔白質(zhì)柱樣品弟作適碗當(dāng)稀乏釋（粥最好保多做揀幾個(gè)何梯度陶，如宏作2倍、4倍、8倍稀核釋4.各孔紛加入20惠0微升BC污A工作撲液，轉(zhuǎn)用加論樣槍辦輕輕挑吹打坑混勻?。ㄗ⒔o意：滑不要村弄出恢氣泡隸影響強(qiáng)讀數(shù)溝），37映℃放置30晃-6卷0分鐘馳。冷卻否到室吐溫后偵，用蛇酶標(biāo)感儀測緒定A5紋62割nm，或54瘋0-碗59虛0n殲m之間奴的其紹他波王長的遍吸光距度，乓根據(jù)西標(biāo)準(zhǔn)