細胞融合與單克隆抗體

第四章

細胞融合與單克隆抗體(kàngtǐ)山東師范大學生命科學學院(xuéyuàn)第一頁，共五十一頁。精選ppt第一節(jié)細胞融合概述(ɡàishù)第二頁，共五十一頁。精選ppt細胞融合（cellfusion)，又稱體細胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過(tōngguò)膜融合形成單個細胞的過程。一、細胞融合的定義(dìngyì)第三頁，共五十一頁。精選pptMuller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內自發(fā)地融合產生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。1958年日本學者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有(jùyǒu)觸發(fā)動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術。二、細胞融合研究進展第四頁，共五十一頁。精選ppt生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種(jǐzhǒnɡ)細胞融合成功的例子第五頁，共五十一頁。精選ppt植物融合(rónghé)細胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合(rónghé)的細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合(rónghé)的細胞

第六頁，共五十一頁。精選ppt動物細胞融合實驗(shíyàn)使用的小白鼠第七頁，共五十一頁。精選ppt三、動植物細胞(xìbāo)的融合過程植物(zhíwù)細胞融合過程人造(rénzào)小鼠培育過程示意圖第八頁，共五十一頁。精選ppt四、細胞融合的意義(yìyì)理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體(kàngtǐ)的制備。第九頁，共五十一頁。精選ppt第二節(jié)細胞融合的基本原理第十頁，共五十一頁。精選ppt顯微鏡下細胞融合過程(guòchéng)第十一頁，共五十一頁。精選ppt融合過程(guòchéng)中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程(guòchéng)圖解第十二頁，共五十一頁。精選ppt用滅活的病毒誘導的動物(dòngwù)細胞融合過程示意圖

第十三頁，共五十一頁。精選ppt第三節(jié)細胞融合的常用(chánɡyònɡ)方法第十四頁，共五十一頁。精選ppt一、仙臺病毒法仙臺病毒誘導細胞融合經四個階段：①兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細胞膜發(fā)生反應(fǎnyìng)，細胞膜受到破環(huán)，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；④融合成巨大細胞，仍需ATP。第十五頁，共五十一頁。精選ppt病毒促使細胞融合的主要(zhǔyào)步驟如下：兩個原生質體或細胞在病毒黏結作用下彼此(bǐcǐ)靠近；通過病毒與原生質體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質互相滲透；兩個原生質體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。第十六頁，共五十一頁。精選ppt用滅活的病毒(bìngdú)誘導的動物細胞融合過程示意圖

第十七頁，共五十一頁。精選ppt

優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。通常(tōngcháng)用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產生最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法第十八頁，共五十一頁。精選ppt聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程(guòchéng)第十九頁，共五十一頁。精選pptPEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成(xíngchéng)H鍵，從而在在質膜之間形成(xíngchéng)分子橋，其結果是使細胞質膜發(fā)生粘連進而促使質膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。

PEG誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制(xiànzhì)。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。

第二十頁，共五十一頁。精選ppt聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟（1）將兩種不同親本(qīnběn)細胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。第二十一頁，共五十一頁。精選ppt第二十二頁，共五十一頁。精選ppt三、電融合法電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察(guānchá)或錄像觀察(guānchá)融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。第二十三頁，共五十一頁。精選ppt電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個(liǎnɡɡè)緊密接觸的細胞融合在一起。

第二十四頁，共五十一頁。精選ppt電融合誘導法原理(yuánlǐ)示意圖第二十五頁，共五十一頁。精選ppt第三節(jié)雜種(zázhǒng)細胞的篩選根據(jù)已經發(fā)生(fāshēng)融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質的融合體。第二十六頁，共五十一頁。精選ppt基于酶缺陷型細胞和藥物(yàowù)抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選常用的雜種(zázhǒng)細胞篩選方法第二十七頁，共五十一頁。精選ppt第四節(jié)細胞(xìbāo)雜交瘤技術與單克隆抗體第二十八頁，共五十一頁。精選ppt一、何謂(héwèi)單克隆抗體？第二十九頁，共五十一頁。精選ppt第三十頁，共五十一頁。精選ppt第三十一頁，共五十一頁。精選ppt第三十二頁，共五十一頁。精選ppt只針對某一抗原決定簇的抗體分子(fēnzǐ)稱為單克隆抗體。第三十三頁，共五十一頁。精選ppt單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此(yīncǐ)，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology

）。第三十四頁，共五十一頁。精選pptNielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第三十五頁，共五十一頁。精選ppt二、雜交瘤技術(jìshù)的基本原理第三十六頁，共五十一頁。精選ppt三、雜交瘤細胞(xìbāo)的制備（一）骨髓瘤細胞(xìbāo)選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇(xuǎnzé)次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十七頁，共五十一頁。精選pptHAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(ānjī)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶(jīméi)缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八頁，共五十一頁。精選ppt（二）免疫(miǎnyì)小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理(chǔlǐ)抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。第三十九頁，共五十一頁。精選ppt（三）脾細胞(xìbāo)的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精(jiǔjīng)消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復抽吸數(shù)次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉／分)計數(shù)、備用。第四十頁，共五十一頁。精選ppt（四）細胞(xìbāo)準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計數(shù)活力(huólì)細胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。第四十一頁，共五十一頁。精選ppt（五）細胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內加完，同時并不斷輕微轉動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內加完；(3)于5分鐘內慢慢(mànmàn)加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第四十二頁，共五十一頁。精選ppt（六）融合(rónghé)后細胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(shēngzhǎng)至1／3孔時，應進行抗體檢測。第四十三頁，共五十一頁。精選pptHAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(ānjī)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖激酶缺陷(quēxiàn)型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第四十四頁，共五十一頁。精選ppt（七）抗體(kàngtǐ)檢測免疫熒光試驗(shìyàn)放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)第四十五頁，共五十一頁。精選ppt（八）單克隆抗體(kàngtǐ)的大量制備體內(tǐnèi)法培養(yǎng)法第四十六頁，共五十一頁。精選ppt四、單克隆抗體(kàngtǐ)的應用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學的疾病診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術可以生產各種免疫疫苗，這不僅(bùjǐn)能大大降低生產成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術。單克隆抗體技術還可廣泛用于各種基礎醫(yī)學研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學的不斷發(fā)展。

第四十七頁，共五十一頁。精選ppt第五節(jié)人源單克隆抗體(kàngtǐ)主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本(qīnběn)。現(xiàn)有的細胞株大多是融合