生物化學(xué)課件

第一部分

生物大分子第一章蛋白質(zhì)生物化學(xué)78879第一章蛋白質(zhì)

本章內(nèi)容簡(jiǎn)介掌握內(nèi)容講授本章要點(diǎn)回顧本章習(xí)題生物化學(xué)78879蛋白質(zhì)（Protein，Pr）——生活細(xì)胞內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜、參與幾乎所有生命活動(dòng)過(guò)程。即蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者——催化功能、調(diào)節(jié)功能、轉(zhuǎn)運(yùn)功能、貯存功能、運(yùn)動(dòng)功能、結(jié)構(gòu)功能、支架功能、防御和進(jìn)攻異常功能生物化學(xué)78879本章主要介紹了氨基酸（AA）、Pr的基礎(chǔ)知識(shí)。重點(diǎn)掌握AA、Pr的結(jié)構(gòu)組成、性質(zhì)的特點(diǎn)及與功能之間的依存關(guān)系。了解常見(jiàn)的活性肽；了解蛋白質(zhì)分離純化的常用方法。生物化學(xué)78879第一章蛋白質(zhì)1.1氨基酸1.2肽鍵1.3生理活性肽1.4Pr的分離和純化1.5Pr的結(jié)構(gòu)與功能生物化學(xué)78879第一章蛋白質(zhì)

1.1氨基酸1.1.1AA的構(gòu)型1.1.2AA的酸堿性質(zhì)與pK值1.1.3AA的茚三酮反應(yīng)生物化學(xué)78879氨基酸（Aminoacid,AA）是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位.構(gòu)成Pr具有遺傳編碼的氨基酸殘基有20種——蛋白質(zhì)氨基酸。P2圖1-1生物化學(xué)78879Aminoacidsarethebuildingblocksofproteins19種氨基酸具有一級(jí)氨基(-NH3+)和羧基(-COO-)結(jié)合到Cα，同時(shí)結(jié)合到Cα上的是H和各種側(cè)鏈R；Pro具有二級(jí)氨基(-NH2+,α-亞氨基酸)生物化學(xué)78879二十種常見(jiàn)蛋白質(zhì)AA的分類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)據(jù)營(yíng)養(yǎng)學(xué)分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

脂肪族AA【中性、含羥基或巰基(一氨基一羧基)、酸性(一氨基二羧基)、堿性(二氨基一羧基)】芳香族AA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)AA(His、Pro)據(jù)R基團(tuán)極性分類極性R基團(tuán)AA非極性R基團(tuán)AA(８種/9種)不帶電荷（７種/6種）帶電荷：正電荷（３種）負(fù)電荷（２種）

人的必需氨基酸MetTrpLysValIleLeuPheThr

假設(shè)來(lái)借一兩本書(shū)Arg、His（半必需AA）生物化學(xué)78879甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Leu,L）異亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫(巰基)脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）生物化學(xué)78879酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）生物化學(xué)78879堿性氨基酸賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)生物化學(xué)78879雜環(huán)氨基酸組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）生物化學(xué)78879芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）生物化學(xué)78879非極性R基團(tuán)氨基酸(Gly-Ala-Val-Leu-Ile-Phe-Met-Pro-Trp疏水性逐漸增大)生物化學(xué)78879極性不帶電荷R基團(tuán)氨基酸生物化學(xué)78879帶電荷R基團(tuán)氨基酸Ser-Thr-Asn-Gln-Tyr-Cys-Asp-Glu-His-Lys-Arg極性AA的R基團(tuán)親水性逐漸增強(qiáng)生物化學(xué)78879二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含支鏈AA：Val、Leu，Ile含羥基的AA：Ser、Thr含硫的AA：Cys(含巰基)、Met(含硫甲基)含苯環(huán)的AA：Phe、Trp、Tyr含胍基的AA：Arg含咪唑基的AA：His亞氨基酸：Pro含酰胺的AA：Asn、Gln含吲哚基的AA：Trp含ε-氨基的AA：Lys生物化學(xué)788791.除R為H（Gly）外,其余AA均具有不對(duì)稱α-碳原子——AA有D/L-構(gòu)型,但構(gòu)成Pr的AA均為L(zhǎng)-氨基酸,在生物界有D-氨基酸的存在。2.AA具有不對(duì)稱α-碳原子—AA具有旋光性3.各種AA的區(qū)別在于側(cè)鏈R基上AA的結(jié)構(gòu)通式生物化學(xué)78879AA的酸堿性質(zhì)p3-4AA既含有氨基，可接受H+，又含有羧基可電離出H+，所以氨基酸具有酸堿兩性性質(zhì)。通常情況下，氨基酸以偶離子——兼（兩）性離子的形式存在，如下圖所示：

生物化學(xué)78879AA的等電點(diǎn)——AA在酸性環(huán)境中主要以陽(yáng)離子H2A+的形式存在,在堿性環(huán)境中主要以陰離子A-的形式存在.在某一pH環(huán)境下,以偶離子形式存在,在電場(chǎng)中既不向陰極也不向陽(yáng)極移動(dòng)——該AA的等電點(diǎn)(isoelectricpoint，pI)，其定義為AA所帶正負(fù)電荷相等時(shí)的溶液pH。p3生物化學(xué)78879與茚三酮的反應(yīng)：除Pro外，可與其它AA生成藍(lán)紫色化合物。Pro在此反應(yīng)中并不釋放NH3，直接生成黃色化合物。在570nm（藍(lán)紫色）或440nm（黃色）定量測(cè)定（0.5-50μg/ml）

與茚三酮反應(yīng)生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879脯氨酸與茚三酮反應(yīng)的產(chǎn)物：N+黃色化合物生物化學(xué)78879肽鍵（peptidebond）：一個(gè)AA的α-COOH和相鄰的另一個(gè)AA的α-NH2脫水形成的共價(jià)鍵。具有部分雙鍵性質(zhì)——不能自由旋轉(zhuǎn)，呈平面結(jié)構(gòu)生物化學(xué)78879N端C端RHHOCCaNCaCRONOCNCaCRONCaHHHHCaH肽鏈中從一個(gè)Cα原子到另一個(gè)Cα原子之間共包含的6個(gè)原子（Cα、C、O、N、H、Cα）在空間共處于同一個(gè)平面——肽/酰胺平面，是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位生物化學(xué)78879肽鍵/酰胺平面與

α-碳原子的二面角（φ和ψ）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點(diǎn)而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角。生物化學(xué)78879腦啡肽：為5肽，具有鎮(zhèn)痛作用。有兩種類型——Met腦啡肽和Leu腦啡肽生物化學(xué)78879第一章蛋白質(zhì)

1.4Pr的分離和純化1.4.1Pr分離、提純一般程序1.4.2Pr的溶解度分級(jí)沉淀1.4.3目的蛋白的精制生物化學(xué)78879一.

分離純化蛋白質(zhì)的意義1.研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性2.提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)3.作為藥物或食品添加劑：純度達(dá)到規(guī)定要求二、蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)：增加制品純度或比活力，設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其他雜蛋白，且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。生物化學(xué)78879蛋白質(zhì)分離純化的一般程序（溫和條件）1.前處理生物組織破碎、溶解、離心分離蛋白質(zhì)提取液2.粗分離

鹽析、等電點(diǎn)沉淀、透析、超濾、有機(jī)溶劑分級(jí)分離3.細(xì)分級(jí)層析、電泳、超速離心——精制精制品4.結(jié)晶結(jié)晶或凍干粉

適宜介質(zhì)生物化學(xué)78879選擇合適原料：動(dòng)物、植物組織、基因工程表達(dá)產(chǎn)物采用不同方法將細(xì)胞破碎得到含有目的蛋白的粗提液——控制提純條件以避免Pr變性生物化學(xué)78879Pr在水中的溶解度取決于Pr的水合度常用加入無(wú)機(jī)鹽的方法來(lái)控制水合度鹽溶:當(dāng)溶液中無(wú)機(jī)鹽的濃度從零增加時(shí),Pr的溶解度有所增加（帶電層使Pr分子彼此排斥而與水分子間的相互作用加強(qiáng)）鹽析:當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一點(diǎn)時(shí),Pr開(kāi)始沉淀（Pr分子表面的水化層被移去溶解鹽離子，使Pr分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)而聚集沉淀）生物化學(xué)78879常用的中性鹽為硫酸銨不同蛋白質(zhì)由于所帶電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需鹽濃度也不同，因此可以將不同蛋白質(zhì)加以分離——鹽析順序的先后差異達(dá)到分級(jí)沉淀

p7圖1-6生物化學(xué)78879+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化層++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用

蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)溶液等電點(diǎn)沉淀作用示意圖生物化學(xué)78879透析與超濾簡(jiǎn)易裝置生物化學(xué)78879層析:離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析、疏水層析電泳：SDS電泳、毛細(xì)管電泳超速離心:密度梯度離心生物化學(xué)78879離子交換層析：以離子交換樹(shù)脂為支持物，樹(shù)脂是一種人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。AA在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固程度即AA與樹(shù)脂間的親和力，主要決定于它們之間的靜電吸引和AA的R基團(tuán)與樹(shù)脂基質(zhì)之間的疏水作用。生物化學(xué)78879陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)是酸性的，如磺酸基-SO3H——強(qiáng)酸型；羧基-COOH——弱酸型

陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)是堿性的，如OH-

生物化學(xué)78879離子交換原理及流程示意圖+生物化學(xué)78879基本步驟：

裝柱

上樣

分步洗脫

分步收集強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂pH2~3，使所有氨基酸帶正電荷，正電荷大小順序：堿性AA>中性AA>酸性AA逐步提高洗脫液pH和離子強(qiáng)度分離AA混合物經(jīng)常使用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，pH2～3上柱,此時(shí)AA主要以陽(yáng)離子形式存在,與樹(shù)脂上的陽(yáng)離子交換而被“掛”在樹(shù)脂上。生物化學(xué)78879由于AA與樹(shù)脂之間還有疏水相互作用，因此，除Asn、Gln、Trp外17種AA的洗出順序?yàn)椋篈sp-Thr-Ser-Glu-Pro-Gly-Ala-Cys-Val-Met-Ile-Leu-Tyr-Phe-Lys-His-ArgpH3時(shí)，AA與樹(shù)脂之間的靜電吸引大小順序?yàn)椋簤A性AA2+＞中性AA+＞酸性AA0因此AA的洗出順序?yàn)樗嵝訟A——中性AA——堿性AA。生物化學(xué)78879凝膠過(guò)濾層析原理生物化學(xué)78879親和層析法生物化學(xué)78879由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和游離的羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而也具有特定的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn)pH=pI

凈電荷=0pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+生物化學(xué)78879++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－電泳現(xiàn)象電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即不同，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。生物化學(xué)78879紙電泳（醋酸纖維薄膜電泳法）生物化學(xué)78879SDS凝膠電泳法低濃度濃縮膠高濃度分離膠生物化學(xué)78879第一章蛋白質(zhì)

1.5Pr的結(jié)構(gòu)和功能1.5.1Pr的結(jié)構(gòu)1.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法1.5.3Pr的變性與復(fù)性生物化學(xué)788791.5.1Pr的結(jié)構(gòu)㈠、Pr結(jié)構(gòu)的一般概念㈡、Pr的一級(jí)結(jié)構(gòu)㈢、Pr的二級(jí)結(jié)構(gòu)㈣、Pr的超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域㈤、Pr的三級(jí)結(jié)構(gòu)㈥、Pr的四級(jí)結(jié)構(gòu)和Pr體系㈦、維持Pr空間結(jié)構(gòu)的作用力生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primarystructure）共價(jià)/初級(jí)結(jié)構(gòu)，包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈的數(shù)目、多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。肽鍵是主要連接鍵，多肽鏈?zhǔn)且患?jí)結(jié)構(gòu)的主體。其中最重要是AA在肽鏈中的排列順序，如改變不僅影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而且將直接影響其生理功能。生物化學(xué)78879肽（鏈）（peptidechain）1）2/3個(gè)AA組成的肽叫二/三肽；多個(gè)AA組成的肽叫多肽；AA借肽鍵連成長(zhǎng)鏈稱為肽鏈2）肽鏈兩端有自由-NH2稱為N-末端（氨基末端,H）和自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端,OH）；有開(kāi)鏈肽和環(huán)鏈肽；

3）構(gòu)成肽鏈的AA已殘缺不全，稱為氨基酸殘基；

4）肽鏈中的AA排列順序一般-NH2端開(kāi)始，由N指向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾；5）-S-S-鍵也包括在一級(jí)結(jié)構(gòu)中，是連接多肽鏈內(nèi)和鏈間的主要橋鍵；二硫鍵數(shù)目越多Pr結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性越強(qiáng)。生物化學(xué)78879N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端氨基酸的順序是N端→C端的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Glu

絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸COOH生物化學(xué)78879常見(jiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元有3類：規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊）、部分規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角）、無(wú)規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)（無(wú)規(guī)卷曲）等Pr二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念：secondarystructure,多肽鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)即主鏈折疊形成由氫鍵維系的有規(guī)則的構(gòu)象。生物化學(xué)78879α-螺旋（α-Helix）:是最常見(jiàn)最典型含量最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件（secondarystructrueelement）A:多個(gè)肽鍵平面通過(guò)α-碳原子旋轉(zhuǎn),主鏈繞一條固定軸形成右手螺旋,每隔3.6個(gè)AA殘基螺旋上升一圈,螺距為0.54nm,每個(gè)AA沿軸上升0.15nm,上升時(shí)每個(gè)AA沿軸旋轉(zhuǎn)100°,AA側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879B:氫鍵（hydrogenbond）——相鄰螺圈之間借肽鍵中C＝O和N-H形成許多鏈內(nèi)氫健，即第n個(gè)AA殘基中的C＝O

和后面第n+4個(gè)AA殘基的N-H之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定α-螺旋的主要鍵Cn—C—(NH—Cα—CO)3

N—Cn+4OHHR3.613(ns)n表示螺旋上升一圈的AA殘基數(shù)目S表示形成一對(duì)氫鍵封閉環(huán)內(nèi)共價(jià)結(jié)構(gòu)的原子數(shù)目生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879β-折疊(β-pleatedsheets)，又稱β-片層,是肽鏈比α-螺旋伸展的重復(fù)性結(jié)構(gòu),其主要作用力也是氫鍵，氫鍵可以在不同肽鏈之間形成,也可以在同一肽鏈的不同肽段之間形成；按β-折疊的走向分為平行式和反平行式兩種。生物化學(xué)78879C端生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-轉(zhuǎn)角經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭。β-轉(zhuǎn)角(β-turn):指Pr的多肽鏈在形成空間構(gòu)象時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)180°的回折，回折處的結(jié)構(gòu)的柔性介于規(guī)則與無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)之間。生物化學(xué)78879細(xì)胞色素C的三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)卷曲randomcoil:有些多肽區(qū)段具有比部分規(guī)則結(jié)構(gòu)更大的柔性,形成沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu).但此結(jié)構(gòu)也不是隨機(jī)出現(xiàn)的,具有特定生物功能.無(wú)規(guī)則卷曲生物化學(xué)78879超二級(jí)結(jié)構(gòu)（模體/花式）Super-secondarystructure,由2個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)單元被連接起來(lái)，進(jìn)一步組合成有特殊幾何排列的局域空間結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu),但不具有蛋白質(zhì)的功能。常見(jiàn)組合方式有：αα、ββ、βαβ。

生物化學(xué)78879超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型ααβββαβ生物化學(xué)78879結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）多肽鏈在二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，是相對(duì)獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體，稱為結(jié)構(gòu)域。其對(duì)于一些簡(jiǎn)單的球狀蛋白質(zhì)分子來(lái)說(shuō)，還是一個(gè)獨(dú)立的功能單位或功能域（fuctionaldomain）生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879多肽鏈在二級(jí)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)再進(jìn)一步折疊，形成包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的專一排布稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)。此時(shí)分子內(nèi)能降低結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。折疊時(shí)的趨勢(shì)是大多數(shù)的親水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的表面，而疏水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，形成疏水的核心。Pr的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）生物化學(xué)78879肌紅蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)生物化學(xué)78879Mb的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)78879

二條或二條以上具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈(亞基，subunit)彼此借非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵）相結(jié)合形成四級(jí)結(jié)構(gòu)。

四級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)是亞基在空間排列的方式。亞基可以相同（均一四級(jí)結(jié)構(gòu)），亦可以不同（非均一四級(jí)結(jié)構(gòu)）

亞基單獨(dú)存在時(shí)沒(méi)有完整的生物活性，只有形成完整四級(jí)結(jié)構(gòu)的寡聚體才有生物功能。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）以血紅蛋白(hemoglobin)為例：生物化學(xué)78879生物化學(xué)78879Hb的四級(jí)結(jié)構(gòu)生物化學(xué)78879血紅蛋白(hemoglobin)生物化學(xué)78879共價(jià)鍵次級(jí)鍵化學(xué)鍵

肽鍵一級(jí)結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)疏水作用鹽鍵范德華力三、四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中重要的化學(xué)鍵——共價(jià)鍵與次級(jí)鍵生物化學(xué)78879維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用生物化學(xué)78879維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力多肽鏈生物化學(xué)788791.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法1、Pr分子中多肽鏈數(shù)目的確定2、多肽鏈的分離：肽鏈的拆開(kāi)、末端分析、氨基酸組成分析（離子交換層析——自動(dòng)分析儀）3、多肽鏈的降解4、肽段的分離5、肽段氨基酸序列測(cè)定6、肽段在多肽鏈中次序的測(cè)定7、二硫鍵定位生物化學(xué)788791.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法

根據(jù)Pr的摩爾數(shù)和其N/C-末端的摩爾數(shù)相比來(lái)確定：一條多肽鏈、多條相同多肽鏈、多條不同多肽鏈——p18生物化學(xué)788791.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法

經(jīng)末端的分析，若該P(yáng)r含有兩條以上的肽鏈，而且肽鏈之間是通過(guò)非共價(jià)鍵連接，使用Pr變性劑（如8M尿素、6M鹽酸胍）將其變性后分開(kāi)；若Pr肽鏈之間通過(guò)共價(jià)鍵（如二硫鍵）相連，則可采取過(guò)甲酸氧化法或巰基乙醇還原法將其分開(kāi)——p18生物化學(xué)78879二硫鍵可被氧化劑（過(guò)甲酸）或還原劑（巰基化合物——巰基乙醇）打開(kāi)?；腔彼嵘锘瘜W(xué)788791.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法鑒定多肽鏈的N-和C-末端殘基:N-末端分析：丹磺酰氯法、2，4—二硝基氟苯法、Edman降解法、氨肽酶法；C-末端分析：肼解法、羧肽酶法；——p18生物化學(xué)78879H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺(丹磺)酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸(具熒光性)與丹磺酰氯反應(yīng)——靈敏度高的酰基化反應(yīng)，常用于測(cè)定蛋白質(zhì)N端AA+HCl生物化學(xué)78879與2,4一二硝基氟苯(DNFB)反應(yīng)————sanger反應(yīng)，測(cè)定Pr的N端AA種類————烴基化反應(yīng)DNFBDNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸生物化學(xué)78879肼解法：Pr/多肽+NH2NH2氨基酸肼化物C-末端AA苯甲醛非水溶性二苯基衍生物水溶性C-末端AA在上清液中離心法

C-末端AA+DNFBDNP-AA乙醚提取層析鑒定Gln、Asn、Cys等被破壞不易測(cè)出，Arg轉(zhuǎn)變?yōu)镺rn。生物化學(xué)78879羧肽酶法

羧肽酶（carboxypeptidase）是肽鏈外切酶，專一性地從C-末端開(kāi)始逐個(gè)向里切，被釋放的AA數(shù)目和種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化有羧肽酶A、B、C、Y四種：羧肽酶A：能釋放除Pro、Arg、Lys之外的所有C-末端殘基；羧肽酶B：只水解堿性AA（Arg、Lys）為C-末端殘基的肽鍵；羧肽酶A和羧肽酶B混合能釋放除Pro之外的任一C-末端殘基；羧肽酶Y：可以作用于任一C-末端殘基；生物化學(xué)788791.5.2Pr結(jié)構(gòu)的研究方法常用化學(xué)法和酶解法將多肽鏈裂解成較小的肽段化學(xué)法：用CNBr斷裂，只斷裂Met形成的肽鍵的C端一側(cè)，反應(yīng)加入70%甲酸，可使卷曲的多肽鏈松散開(kāi)來(lái)，有利于和CNBr作用酶解法：一般用蛋白水解酶，是肽鏈內(nèi)切酶，能切斷肽鏈內(nèi)部某些AA形成的肽鍵。常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胃蛋白酶等生物化學(xué)78879a：胰蛋白酶：專一性強(qiáng)，只斷裂Arg和Lys形成的肽鍵的C端一側(cè)，得到的是以Arg和Lys為C-末端殘基的肽段，產(chǎn)生的肽段數(shù)目等于多肽鏈中Arg和Lys的總數(shù)加1。b：胰凝乳蛋白酶：作用于Phe、Tyr、Trp芳香族和疏水AA形成的肽鍵的C端一側(cè)，但水解前者速度比后者快。最適pH8～9。c：胃蛋白酶：專一性與胰凝乳蛋白酶類似，但要求斷裂點(diǎn)兩側(cè)都是疏水AA，最適pH2，由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置常用此酶來(lái)水解。生物化學(xué)788791.5