細(xì)胞工程第8章 動(dòng)物克隆與核移植技術(shù)

動(dòng)物克隆與核移植技術(shù)克隆(clone)是指用無(wú)性方式產(chǎn)生的后代群體。分子水平：基因克隆細(xì)胞水平：細(xì)胞克隆個(gè)體水平：動(dòng)物、植物克隆動(dòng)物克隆指不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程，而是通過(guò)核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同的動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。動(dòng)物克隆是一種通過(guò)核移植過(guò)程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。經(jīng)過(guò)核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。動(dòng)物克隆技術(shù)包括細(xì)胞核移植技術(shù)和卵裂球培養(yǎng)、胚胎分割技術(shù)。核移植技術(shù)：利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。

核移植技術(shù)最早由德國(guó)著名胚胎學(xué)家Spemann于1938年首次提出,研究工作主要集中在兩棲動(dòng)物和魚類。哺乳動(dòng)物的核移植研究始于1969年,但由于其卵母細(xì)胞較小,而且是體內(nèi)發(fā)育,給研究工作帶來(lái)一定難度。1995年首次用胚盤細(xì)胞作為供體細(xì)胞培養(yǎng)出了2頭羊,它標(biāo)志著哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植的開端。1997年首次以成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞為核供體的克隆羊“多莉”成功誕生，證明了高度分化的體細(xì)胞仍具有全能性。之后相繼以體細(xì)胞為核供體培養(yǎng)出了克隆小鼠、牛、山羊、豬等。核移植技術(shù)簡(jiǎn)史核移植技術(shù)類型供體細(xì)胞核的來(lái)源胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植核移植目的生殖性克?。寺∪耍┲委熜钥寺。寺∨咛ィ┕┦荏w種間關(guān)系同種核移植異種核移植核移植技術(shù)的一般操作程序（重點(diǎn)）

1．核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備2．核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備3．細(xì)胞核移植4．激活5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)6．胚胎移植1．核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備

核移植的受體細(xì)胞常為去核卵母細(xì)胞。這是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過(guò)程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開始個(gè)體發(fā)育過(guò)程。卵母細(xì)胞的來(lái)源有兩種方式：一是用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MⅡ卵母細(xì)胞。二是收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。核移植技術(shù)的一般操作程序2．核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備

在核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整的二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動(dòng)物完整的基因組；供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過(guò)程的倒轉(zhuǎn)，變得如同剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過(guò)程。

供體細(xì)胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細(xì)胞。另外，核供體細(xì)胞的來(lái)源還有胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。

核移植技術(shù)的一般操作程序3．細(xì)胞核移植常用的核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個(gè)外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的方法。透明帶下注射則是把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合。核移植技術(shù)的一般操作程序4．激活

卵母細(xì)胞的激活涉及的因素很多，無(wú)論是受精引起的卵母細(xì)胞激活還是人工的激活，都會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)生一系列的反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過(guò)電刺激等方法使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)。

核移植技術(shù)的一般操作程序5．重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)

經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體進(jìn)行體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚的發(fā)育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內(nèi)培養(yǎng)方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入休情期的母羊結(jié)扎的輸卵管中體內(nèi)培養(yǎng)4-7d，發(fā)育至桑椹胚和囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內(nèi)作體內(nèi)培養(yǎng)7d，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。核移植技術(shù)的一般操作程序6．胚胎移植

重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。核移植技術(shù)的一般操作程序克隆羊與體細(xì)胞核移植卵細(xì)胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過(guò)程融合后的卵細(xì)胞它證明了一個(gè)已經(jīng)完全分化了的動(dòng)物體細(xì)胞仍然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息，并且經(jīng)此技術(shù)處理后，體細(xì)胞恢復(fù)了失去的全能性形成完整個(gè)體。多利羊的成功提示我們，在培育體細(xì)胞成為核供體之前，利用“基因靶”技術(shù)精確地誘發(fā)核基因的遺傳改變或精確地植入目的基因，再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些產(chǎn)生了令人滿意變化的細(xì)胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就是說(shuō)，我們可以按照人的意志去改選、生產(chǎn)物種。核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，

進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)；2．培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群；3．開展異種動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物；4．與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆5．利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問(wèn)題?？寺〖夹g(shù)存在的問(wèn)題

理論問(wèn)題分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過(guò)程）的機(jī)理還不清楚；克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡?？寺?dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基