生物學(xué)第三章 抗體123

第三章抗體〔Ab〕

內(nèi)容一、根本概念二、免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)三、免疫球蛋白的特點(diǎn)與功能四、抗體的生物學(xué)活性五、免疫球蛋白的免疫原性六、人工制備的抗體抗體〔antibody,Ab)：機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反響的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。免疫球蛋白〔Immunoglobulin，Ig〕是將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)。一、根本概念因?yàn)樽畛跤腥擞秒娪咀C明血清中抗體活性在γ球蛋白局部，故曾把抗體統(tǒng)稱為兩種(γ)球蛋白。后來(lái)證明，抗體并不都在γ區(qū)；而且位于γ區(qū)的球蛋白，也不一定都具有抗體活性。1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門(mén)會(huì)議，將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥等患者血清中存在的異常免疫球蛋白以及“正常人〞天然存在的免疫球蛋白亞單位等。因而免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念?？贵w和免疫球蛋白的關(guān)系:抗體都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗體活性。分泌型Ig(sIg)和膜型Ig(mIg)。二、免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)〔一〕免疫球蛋白的根本結(jié)構(gòu)四肽鏈結(jié)構(gòu)，鏈間二硫鍵連接;兩條重鏈〔H〕和兩條輕鏈〔L〕;氨基端和羧基端。(1)根據(jù)重鏈分類：根據(jù)重鏈靠近羧基末端氨基酸組成及排列順序不同，將重鏈分為五種：γ、α、μ、δ、ε根據(jù)重鏈組成不同，將Ig分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)根據(jù)輕鏈分型：κ、λ型

各類Ig都有κ、λ兩型輕鏈分子。

1.重鏈與輕鏈根據(jù)氨基酸排列順序的不同分為：可變區(qū)〔V區(qū)〕：氨基酸組成、排列順序變化較大恒定區(qū)〔C區(qū)〕：氨基酸數(shù)量、種類、排列順序及含糖量都比較穩(wěn)定鉸鏈區(qū)(hingeregion)：位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。

2.可變區(qū)與恒定區(qū)超變區(qū)〔HVR〕輕鏈：24-34、50-56、89-97重鏈：31-35、50-65、95-102框架區(qū)〔FR〕超變區(qū)決定簇互補(bǔ)區(qū)〔CDR〕Ig的抗原結(jié)合部位，該部位也稱為CDRIg的獨(dú)特型決定簇

位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。3.鉸鏈區(qū)4.J鏈和分泌片

J鏈?zhǔn)且粭l多肽鏈，富含半胱氨酸，由漿細(xì)胞合成，以二硫鍵的形式共價(jià)結(jié)合到Ig的重鏈上。分泌片：由黏膜上皮細(xì)胞合成和分泌，以非共價(jià)形式結(jié)合到二聚體上，保護(hù)IgA，使之不受環(huán)境中酶的破壞，并介導(dǎo)IgA的轉(zhuǎn)運(yùn)?！捕趁庖咔虻鞍椎乃馄文竟系鞍酌?papain)水解IgG：得到兩個(gè)相同的Fab段和一個(gè)Fc段。

〔二〕免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一個(gè)具有雙價(jià)活性的F〔ab’〕2段和假設(shè)干個(gè)小分子多肽碎片〔pFc’〕。〔三〕免疫球蛋白的功能區(qū)Ig的H鏈、L鏈每隔110個(gè)氨基酸即由鏈內(nèi)二硫鍵連接形成一個(gè)能行使特定功能的球性單位，稱為Ig的結(jié)構(gòu)域或功能區(qū)〔domain〕。VH和VL:識(shí)別和結(jié)合抗原；CH和CL:同種異型的遺傳標(biāo)志CH2:補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)，IgG可通過(guò)胎盤(pán)CH3/CH4:與多種細(xì)胞外表的FcR結(jié)合(免疫調(diào)理,I型超敏反響)各功能區(qū)的作用IgG多為單體，是唯一能通過(guò)胎盤(pán)的抗體，據(jù)重鏈〔鏈〕免疫原性，IgG分4個(gè)亞型。〔一〕IgG三、五類免疫球蛋白的特性與功能

IgG1、IgG2和IgG3能通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體；〔補(bǔ)體是存在于人或脊椎動(dòng)物血清與組織液和細(xì)胞膜外表的一組被激活后具有酶活性的蛋白質(zhì),包含30多種成分,被稱為補(bǔ)體系統(tǒng)?！逞搴孔罡?5%～85%，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體；半衰期較長(zhǎng)：16～24d；主要的作用：溶解靶細(xì)胞、促進(jìn)吞噬、中和、溶解病毒、炎癥介質(zhì)作用；參與II、III型超敏反響。IgG的特點(diǎn)

為五聚體，是分子量最大的Ig，稱巨球蛋白。IgM激活補(bǔ)體、結(jié)合抗原、免疫調(diào)理作用比IgG強(qiáng)。

天然血型抗體是IgM?！捕矷gMIgM是個(gè)體發(fā)育中最早產(chǎn)生的抗體，胚胎晚期已能合成，新生兒臍帶血中假設(shè)IgM水平升高，提示胎兒曾有宮內(nèi)感染。IgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，半衰期短，故檢測(cè)IgM水平可用于傳染病的早期診斷。mIgM是B細(xì)胞抗原受體〔BCR〕的主要成分,也可參與II、III型超敏反響。IgM的特點(diǎn)mIgM是B細(xì)胞抗原受體〔BCR〕的主要成分,也可參與II、III型超敏反響(一型過(guò)敏反應(yīng)：立即性過(guò)敏反應(yīng)(immediatehypersensitivityreaction)。機(jī)制：體內(nèi)原先曾接觸過(guò)敏原，且已經(jīng)對(duì)過(guò)敏原產(chǎn)生特異性抗體(IgE)。當(dāng)再次接觸過(guò)敏原時(shí)，體內(nèi)肥大細(xì)胞(mastcells)或嗜堿性粒細(xì)胞(Basophils)立即釋放組織胺(histamine),leukotrienes等引起過(guò)敏癥狀的物質(zhì)。二型過(guò)敏反應(yīng)：細(xì)胞毒性〔cytotoxic〕機(jī)制：體內(nèi)內(nèi)原先曾接觸過(guò)敏原，且已經(jīng)對(duì)過(guò)敏原產(chǎn)生特異性抗體(IgG或IgM)。具特異性的IgG或IgM抗體與細(xì)胞外表的過(guò)敏原結(jié)合，藉由活化補(bǔ)體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞，破壞被過(guò)敏原所附著的細(xì)胞。三型過(guò)敏反應(yīng)：透過(guò)免疫複合物活化補(bǔ)體(immunecomplex)機(jī)制：過(guò)敏原與體內(nèi)的IgG或IgM形成免疫複合物，堆積在體內(nèi)，引起補(bǔ)體被活化，造成組織的破壞。四型過(guò)敏反應(yīng)：遲發(fā)型，細(xì)胞媒介(cell-mediated)機(jī)制：過(guò)敏原引起體內(nèi)CD4+T細(xì)胞被活化，因而釋出細(xì)胞間素〔cytokine〕導(dǎo)致組織和器官受損，常於暴露過(guò)敏原24-72小時(shí)後發(fā)生。

)分為血清型和分泌型兩種。血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，占免疫球蛋白的10%-15%,為單體。而分泌型IgA〔sIgA〕是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細(xì)胞產(chǎn)生，為雙體。sIgA主要存在于唾液、淚液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜外表的分泌液中。(三)IgAIgA的特點(diǎn)參與皮膚粘膜的局部抗感染作用；初乳中含有高濃度的sIgA----母乳喂養(yǎng)；通過(guò)替代途徑激活補(bǔ)體；參與Ⅲ型超敏反響。sIgA的合成和主要作用部位在黏膜很少分泌，在血清中含量極低，占血清總Ig的0.2%，在血清中含量為30ug/ml,不穩(wěn)定，易降解，IgD是B細(xì)胞的重要外表標(biāo)志，mIgD的出現(xiàn)標(biāo)志著B(niǎo)細(xì)胞成熟，對(duì)防止免疫耐受有一定作用。(四)IgD血清中含量很低，在血清中含量為0.3ug/ml,是一類親細(xì)胞抗體，可與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞上的高親和力Fcε受體FcεRⅠ〕〔γ、α、μ、δ、ε〕結(jié)合，引起Ⅰ型超敏反響，F(xiàn)cεRⅡ分布于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞。(五)IgE四、免疫球蛋白的生物學(xué)活性

V區(qū)的功能:

Fab片段的生物學(xué)活性抗體結(jié)合抗原的活性由Fab所呈現(xiàn)，由VH和VL所組成的抗原結(jié)合部位，可結(jié)合抗原，是決定抗體分子特異性的部位。

C區(qū)的功能：

Fc片段的生物學(xué)活性：該片段無(wú)結(jié)合抗原活性，但與抗體分子的生物學(xué)活性有密切關(guān)系：1、選擇性地通過(guò)胎盤(pán)；2、與補(bǔ)體結(jié)合活化補(bǔ)體；3、決定Ig分子的親細(xì)胞性(即與帶Fc受體細(xì)胞的結(jié)合)；4、Ig通過(guò)粘膜進(jìn)入外分泌液等都是Fc片段的功能。

補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)位于CH2上；Fc受體結(jié)合位點(diǎn)在CH3上。

五、免疫球蛋白的免疫原性Ig是蛋白質(zhì)，因此一種動(dòng)物的Ig對(duì)另一種動(dòng)物而言是良好的抗原。Ig抗原特異性：Fc片段是Ig分子中的重鏈恒定區(qū)，因此它是決定各類Ig抗原特異性的部位。用Ig免疫異種動(dòng)物產(chǎn)生的抗抗體(第二抗體)，可與相應(yīng)Ig發(fā)生抗原抗體反響。免疫球蛋白的不同結(jié)構(gòu)區(qū)其免疫原性不同：同種型〔isotype〕：指在同一種動(dòng)物所有個(gè)體的不同類型的Ig共同具有的抗原特異性，同種間不表現(xiàn)出抗原性，只是在異種動(dòng)物之間才表現(xiàn)出抗原性。Ig的同種型抗原決定簇主要存在于重鏈C區(qū)。同種異型〔allotype〕：指Ig在同一種動(dòng)物不同個(gè)體之間呈現(xiàn)出的抗原性。同種異型的抗原決定簇存在于IgG、IgA、IgE的重鏈C區(qū)和k型輕鏈的C區(qū)。同種異型是Ig穩(wěn)定的遺傳標(biāo)志，可用于親子鑒定。獨(dú)特型〔idiotope〕：抗體分子的特異性是由Ig的重鏈和輕鏈可變區(qū)所決定的，因此體內(nèi)針對(duì)不同抗原分子的抗體之間的差異表現(xiàn)在Ig分子的可變區(qū)，這種差異就決定了抗體分子在機(jī)體內(nèi)具有抗原性，由抗體分子的可變區(qū)呈現(xiàn)的抗原性就稱為Ig的獨(dú)特型。

獨(dú)特位：獨(dú)特型由Ig可變區(qū)假設(shè)干個(gè)抗原決定簇所組成，它們被稱為獨(dú)特位。獨(dú)特型在異種、同種異體乃至同一個(gè)體內(nèi)均可刺激產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，稱為抗獨(dú)特型抗體。同種型(isotype):同一物種內(nèi)所有個(gè)體共同具有的Ig抗原特異性結(jié)構(gòu)。同種型Ig的抗原決定簇存在于CH、CL據(jù)CH的不同，Ig分類、亞類據(jù)CL的不同，Ig分型、亞型同種異型〔allotype)：同一物種內(nèi)不同個(gè)體間的Ig免疫原性的差異。獨(dú)特型〔idotype)：同一個(gè)體內(nèi)不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的Ig其超變區(qū)各自具備獨(dú)特的抗原決定簇結(jié)構(gòu)。1、多克隆抗體：多個(gè)抗原決定基——機(jī)體——多種抗體的混合物。2、單克隆抗體〔monoclonalantibody,mAb〕：由一個(gè)B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞〔漿細(xì)胞〕產(chǎn)生的、針對(duì)某一特定抗原決定簇的高度特異性抗體。3、基因工程抗體：利用基因工程技術(shù)來(lái)制備的抗體分子稱為基因工程抗體，是分子水平的抗體。六、人工制備的抗體1、多克隆抗體(PcAb)采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質(zhì)經(jīng)不同途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)免疫后，別離出血清，由此獲得的抗血清即為多克隆抗體。細(xì)菌病毒抗原，均是由多種抗原成分組成，即使純蛋白質(zhì)抗原分子也含有多種抗原表位，因此進(jìn)入機(jī)體后可激活許多淋巴細(xì)胞克隆，機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)各種抗原成分或抗原表位的抗體，由此獲得的抗血清是一種多克隆的混合抗體，具有高度的異質(zhì)性。一只小鼠能產(chǎn)生約107-108種不同抗體，人約109種。2、單克隆抗體(McAb)由一個(gè)B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞(漿細(xì)胞)產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

McAb的特點(diǎn)：McAb的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨(dú)特型的特異性、親和力、生物學(xué)性狀及分子結(jié)構(gòu)均完全相同。McAb技術(shù)原理：用人工的方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞與同系骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖特性，又具有B細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，由克隆化的B細(xì)胞雜交瘤所產(chǎn)生的抗體即為單克隆抗體?！捕矪細(xì)胞雜交瘤株建立與McAb生產(chǎn)技術(shù)根本過(guò)程：B細(xì)胞的制備、骨髓瘤細(xì)胞的制備---細(xì)胞融合---檢測(cè)抗體--雜交瘤細(xì)胞的克隆化---細(xì)胞株凍存或單克隆抗體的生產(chǎn)。單克隆抗體的問(wèn)世，極大地推動(dòng)了免疫學(xué)及其他生物科學(xué)的開(kāi)展，并于1984年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。McAb優(yōu)點(diǎn)與多克隆抗體比較，McAb具有無(wú)可比較的優(yōu)越性，具有高特異性、高純度、均質(zhì)性好、親和力不變、重復(fù)性強(qiáng)、效價(jià)高、本錢(qián)低、并可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

(1)B細(xì)胞的制備：可用提純的抗原免疫Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次間隔2-4周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾臟，制成103/ml的脾細(xì)胞懸液，即為親本的B細(xì)胞。

(2)骨髓瘤細(xì)胞的制備：用與免疫相同品系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞，要求其本身不能分泌Ig，而且具有某種營(yíng)養(yǎng)缺陷，可用SP2/0或NS-1，它們?nèi)鄙俅吸S嘌呤--鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能在HAT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。(3)飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備：常用小鼠巨噬細(xì)胞或胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。(4)選擇培養(yǎng)基：常用HAT選擇培養(yǎng)基，H為次黃嘌呤，T為胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成DNA的原料；A是氨基喋呤，是細(xì)胞內(nèi)源性合成DNA的阻斷劑。在該培養(yǎng)基中，末融合的骨髓瘤細(xì)胞不能生長(zhǎng)，因它不能利用旁路途徑合成DNA，內(nèi)源性的合成又受到氨基喋吟的阻斷；至于未融合的脾細(xì)胞那么在2周內(nèi)自然死亡，所以只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(5)細(xì)胞融合將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按一定比例(一般3:1-5:1)混合，離心后棄上清液，然后緩慢參加融合劑50％聚乙二醇(PEG4000)，搖動(dòng)試管。靜置90s，逐漸參加HAT培養(yǎng)基，分于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板孔中，置5％-10％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后更換一半HAT培養(yǎng)基，再5d后改用HT培養(yǎng)基，再經(jīng)5d后用完全DMEM培養(yǎng)基。

(6)檢測(cè)抗體雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后，應(yīng)用敏感的血清學(xué)方法檢測(cè)各孔中的抗體。視抗原性質(zhì)的不同，可采用放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)間接法等。通過(guò)檢測(cè)篩選