基因診斷與基因治療課件

第二十一章基因診斷與基因治療1第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）亦稱分子診斷、DNA診斷。采用分子生物學的技術方法來分析受檢者的某一特定基因的結構（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來對相應的疾病進行診斷。2二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理

檢測相關基因的結構及其表達功能特別是RNA產物是否正常

2基因診斷的方法 （1）DNA診斷 （2）RNA診斷3（1）DNA診斷

1）限制性片段長度多態(tài)性2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）單鏈構象多態(tài)性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA診斷1）RNA印跡（Northernblot）2)RT-PCR41）限制性片段長度多態(tài)性 —基因連鎖分析（1）方法原理：

待測DNA序列中的點突變導致了某一限制性內切酶識別位點的改變可引起其特異的限制性內切酶片段的大小與多少隨之改變，即而通過Southern印跡雜交和限制性內切酶酶譜分析診斷出點突變。56（2）診斷原理

在人群中，個體間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性可以改變限制性內切酶的切割位點，產生DNA限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。67

RFLP按照孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某一種致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種遺傳性標志來判斷家族成員或胎兒的基因組中是否攜帶致病基因。7889（2）應用A

sickle-cellanemia的基因診斷a.

病因血紅蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常為谷氨酸，貧血時突變?yōu)轭R氨酸。9101234561011b.

檢測限制性內切酶：Sau1酶切位點：CCTNAGG探針：標記的β珠蛋白1112

c.結果分析切割正常待測血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產生1.1kb切割異常待測血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產生1.3kb12131314

1415（1）原理

根據已知的基因突變位點的核苷酸序列，人工合成相應于突變基因異常核苷酸序列的寡核苷酸作為雜交探針，從而直接檢測和鑒定突變基因。2）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法

（allelespecificoligonucleotide,ASO）

1516

相應于突變基因異常相應于正常基因

核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷雜交探針酸雜交探針與受檢者DNA進行分子雜交

發(fā)生雜交

均可雜交與異常不發(fā)生雜交(突變純和子）

（雜和子）與正常發(fā)生雜交(正常純和子）

161717181）病因H-ras（化學誘導）

ras家族K-ras編碼P21蛋白N-ras（自然發(fā)生)ras家族點突變好發(fā)于12、13、61位密碼子

（2）應用

—大腸癌K-ras的基因診斷18192）檢測

a、PCR擴增

用人工合成的位于待測點突變兩側的引物，分別擴增含12、13、及61位點的基因片段。1920b、ASO分析

①

將擴增產物結合在尼龍膜上分別與ras原癌基因密碼子12、13、61所有可能引起堿基突變的寡核苷酸探針進行雜交；

②

雜交后，膜經嚴格的洗滌，僅允許完全相配的雜交雙鏈存在；

③針結合處在光膠片上呈陽性斑點2021223）mRNA的檢測

（1）原理

通過對mRNA進行定量、檢測其剪接加工的缺陷以及外顯子變異等判斷基因能否轉錄、轉錄物（mRNA）是否正常以及轉錄效率的高低。2223*mRNA不穩(wěn)定可將其轉為cDNA再用PCR技術進行研究（RT-PCR）2324（2）應用視網膜母細胞瘤：Rb基因缺陷 Rb1基因的mRNA全長4.7kb采用RT-PCR技術分析外顯子突變或mRNA前體剪接異常。2425分析外顯子19至22間的基因突變

逆轉錄引物：外顯子22反義鏈序列

5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3 `

PCR引物:外顯子22正義鏈序列

5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`

外顯子19正義鏈序列

5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2526用RT-PCR檢測艾滋病26三、基因診斷的應用1.遺傳疾病的診斷 產前診斷、遺傳病易感性2感染性疾病（1）病毒性感染（2）細菌性感染（3）寄生蟲（4）其他273惡性腫瘤4法醫(yī)學中應用28（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）可變串聯(lián)重復序列小衛(wèi)星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（2）短串聯(lián)重復（shorttandemrepeat,STR）多態(tài)性分析微衛(wèi)星DNASTR—PCR30第二節(jié)基因治療的基本概念和基本策略

一基因治療（genetherapy）的概念1、背景與歷史疾病的分子生物學了解

新技術新方法（特別是重組DNA）的迅速發(fā)展31

1989年5月28日

第一個基因標記計劃

（TIL-NeoR）

1990年9月11日

第一個基因治療計劃

（ADA-SCID）

32

1995年NIH組織Orkin、Motoksy對頭5年基因治療評估3點建議：發(fā)展載體技術疾病的分子機制動物模型成立3個國家實驗室2000年2月532個計劃，3400余個病人

33病種：惡性腫瘤62.2%

遺傳性疾病13.3%

AIDS6.8%

心血管疾病6.8%

其他1.3%

342、定義

基因角度：正?；蛴泄δ艿幕蛑脫Q或增補缺陷基因。治療角度：新的遺傳物轉移到某個體獲治療效果。

353、方式

基因矯正和置換:同源重組

基因增補:ADA、血友病

基因封閉:myc基因過度表

達，反義抑制

活化前體藥物基因治療：36

單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因導入腫瘤細胞合成HSV-TK無毒性的抗病毒有毒性的抗病毒藥物（GCV）藥物（GCV三磷酸）

細胞死亡374、導入方式

exvivo基因轉移

invivo基因轉移38

第三節(jié)基因治療的條件1、

目的基因的種類：細胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受體基因391、

目的基因的獲得方法

1）

真核基因組DNA文庫中

目的基因的克隆

2）

cDNA文庫中目的基因的

克隆

3）

人工合成基因片段

4）

PCR法篩選擴增目的基因401、

外源基因的要求

1）

含信號肽的cDNA，序列

正確

2）

必要的調控元件（順式

作用元件啟動子、增強

子、靜止子）

413）

外源基因進入細胞核轉錄，

再轉移至細胞漿，間隔序

列（內含子），剪接信號

（SA,SD）PolyA信號，核

內轉錄因子

4）

翻譯的起始密碼子、終止

密碼子、內核糖體進入位

點（IRES）元件

5）

外源基因的丟失、失活、甲基

化

424、基因治療的靶細胞（targetcell）1）

生殖細胞全世界受嚴格控制2）體細胞選擇的標準：A、

容易取出和移植B、

容易體外培養(yǎng)C、

目的基因高效導入D、

細胞壽命長43常用靶細胞；

自體、

同種異體、

異種、

淋巴、骨髓、皮膚、肝、肌、

腫瘤細胞等

4445基因導入的方式：

exvivo——體外將基因導入target

cell,然后將此修飾過

的細胞回輸給病人。

Invivo——外源基因直接導入體

內有關的組織器官。

46

3、基因導入（轉移）的工具與方法。將外源基因或DNA片斷導入宿主細胞進行擴增或表達，需要有一個能在該宿主細胞進行復制和表達的載體（vector）來攜帶。前者與后者在體外構成重組DNA分子，然后導入宿主細胞。47

1）非病毒方法

48

49（一）磷酸鈣轉染技術磷酸鈣--DNA導入細胞吞噬體轉運細胞器瞬時穩(wěn)定外源基因存在外源基因非特異于染色體DNA外與宿主染色體DNA重組12小時內表達持續(xù)約3-4天降解穩(wěn)定轉化細胞株50（二）DEAE-葡聚糖轉染技術（略）

51（三）脂質體轉染法（20%）聚陽離子脂質體-DNA脂質體DNA陽離子復合物

負電荷的細胞膜吸收此復合物（融合吸收）優(yōu)點：簡便、低毒性、無免疫原性、無病毒產生、化學成分已知可大量商業(yè)供應缺點：轉染效率低，短暫表達

52（四）電穿孔轉染技術

靶細胞（懸浮態(tài)）+外源目的DNA

電穿孔儀高壓電脈沖

靶細胞膜發(fā)生瞬時可逆性破裂

形成微孔

外源目的DNA進入靶細胞

53（五）基因槍技術電子發(fā)射裝置或高壓氣流

金或鎢顆粒包裹外源目的DNA形成“子彈”

打入靶細胞54上述物理、化學方法轉移基因的缺點：

1）

轉移效率低，多應用于實

驗研究

2）

維持時間短

2、病毒方法

55在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，以病毒載體最為常用，其優(yōu)點：1）

易于改造與操作2）

轉移效率高3）較高的靶細胞特異性56病毒載體：

逆轉錄病毒(retrovirus)載體

————用于具有分裂功能的

細胞中進行基因轉移

與表達57

腺病毒(adenovirus)、腺相關病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性細胞中進行基因轉移與表達

58（六）逆轉錄病毒載體

1、逆轉錄病毒的結構

由2條相同的38S單鏈

RNA組成

2、逆轉錄病毒的生活周期

59

6061

感染宿主細胞

病毒基因組的整和

原病毒DNA的轉錄與翻譯

逆轉錄病毒顆粒的釋放623、原病毒DNA的結構特點63

644、逆轉錄病毒載體的構建65

665、包裝細胞系的構建

1）沒有包裝細胞，逆轉錄病毒載體就不能裝配成假

病毒顆粒感染靶細胞，完成外源基因的高效轉移67

2）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包裝信號ψ一段序列

輔助病毒

整和NIH3T3染色體形成包裝細胞系

轉錄編碼病毒結構基因攜帶外源基因的逆不能包裝成病毒顆粒轉錄病毒載體（含有包裝信號）導入該細胞系提供病毒結構基因提供包裝信號

包裝成僅含有外源目的基因假病毒686、逆轉錄病毒-包裝細胞系的

特點

1）

感染增殖分裂的細胞

2）

轉移效率高

3）

有效整和、傳代

4）

宿主范圍廣

（七）腺病毒載體

1、腺病毒載體的結構

6970713、腺病毒載體的特點

1）

可感染非增殖分裂的細胞

2）

易于培養(yǎng)與儲存

3）

非整和

4）

可致免疫反應

（八）質粒DNA直接注射72

基因治療的基本過程

73

靶基因+載體————重組DNA分子—————靶細胞————病人

74舉例：

細胞因子修飾腫瘤細胞降

低其致瘤性提高其免疫原性

75

1、

靶基因：細胞因子（α-

TNF,IL-2,γ-IFN,等）

2載體：逆轉錄病毒

ψ

LTRgagpolenvLTR

76逆轉錄病毒載體PLN系列：

ψ

LTRNEOLTR

77

3、包裝細胞：PA317,包裝

為病毒

4、感染靶細胞

5、在靶細胞中表達基因產物

78基因治療的安全性問題:2次事故靶向性、效、基因整合位點、表達調控79基因敲除（knockout）與基因添加（knockin）遺傳工程生物中，一個正?；蚩杀粠追N方式所改變方法1：正?；蛲耆换虻耐蛔兛截愃鎿Q

可以在沒有正?；虻母蓴_下提供突變基因活性的信息

80方法2正?；驈氐资Щ?/p>

應用于獲得正常基因在整體生物中的可能功能的信息方法3一個突變基因加入到基因組

最易進行的遺傳工程8182轉基因動物的概念

用實驗方法把外源基因導入動物的受精卵，再將這一受精卵接種到借腹懷孕的寄養(yǎng)雌性動物（fostermother）的子宮內，使之發(fā)育繁殖，這時外源基因與動物本身的基因組整合，外源基因就能隨細胞分裂而增殖，再體內表達，并傳給下一代，這樣生育的動物稱為轉基因動物8384小鼠基因置換過程的總結8586動物藥廠的基本概念8788樹立質量法制觀念、提高全員質量意識。7月-237月-23Wednesday,July5,2023人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。01:14:5301:14:5301:147/5/20231:14:53AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。7月-2301:14:5301:14Jul-2305-Jul-23加強交通建設管理，確保工程建設質量。01:14:5301:14:5301:14Wednesday,July5,2023安全在于心細，事故出在麻痹。7月-237月-2301:14:5301:14:53July5,2023踏實肯干，努力奮斗。2023年7月5日1:14上午7月-237月-23追求至善憑技術開拓市場，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務樹立形象。05七月20231:14:53上午01:14:537月-23嚴格把控質量關，讓生產更加有保障。七月231:14上午7月-2301:14July5,2023作業(yè)標準記得牢，駕輕就熟除煩惱。2023/7/51:14:5301:14:5305July2023好的事情馬上就會到來