血液細胞組織化學幻燈片

關于血液細胞組織化學幻燈片第1頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三概述

細胞化學染色是在組織化學的基礎上發(fā)展起來的一個學科分支，是細胞學與化學相結合而形成的一門科學，研究細胞的化學成分，在保存血液細胞形態(tài)的基礎上，在細胞原位顯示化學反應的結果，根據(jù)化學反應的原理，研究細胞成分的化學性質(zhì)。

第2頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三研究目的及臨床應用

研究正常血液細胞的活動與生理功能提高血液病的診斷和鑒別診斷水平

確定急性白血病的類型

有助于某些血液病的鑒別診斷觀察療效和估計預后

探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機制

第3頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三標本的選擇

BM片、血片、淋巴結印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色的標本應盡可能新鮮。用于非酶染色的標本可在室溫下放置1個月，如PAS標本。

第4頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三固定的目的及方法

目的保持細胞生前的結構與化學成分，并使血膜在染色、沖洗過程中不易脫落損壞。常用化學固定方法

甲醛蒸汽固定：將濾紙平鋪于染色缸底部，加入少許40%甲醛溶液。將涂片標本放入缸內(nèi)，加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘，水洗后晾干。液體固定：常用的固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用兩種或兩種以上成分組成混合固定液。

第5頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三顯示方法

純化學方法

金屬沉淀法

偶氮偶聯(lián)法

聯(lián)苯胺色素法

Schiff反應

普魯士藍反應類化學方法

物理學方法第6頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三復染方法

復染是細胞內(nèi)化學成分顯色后，為了便于觀察而進行的對比染色方法。

細胞核復染法：常用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。

細胞漿復染法：常用染料為伊紅、光綠等第7頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）第8頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三目的急性白血病的鑒別診斷

AML：陽性

ALL：陰性第9頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三分布特點-1原粒細胞：陰性，白血病副原粒細胞可呈陽性反應。中性粒細胞：自早幼粒細胞起隨細胞成熟陽性強度遞增。陽性顆粒圓形，規(guī)則，直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿，比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細胞：陽性反應，顆粒比中性粒細胞的大，著色深。嗜堿粒細胞：陰性反應，在CML時可出現(xiàn)陽性反應。第10頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三分布特點-2在粒細胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒的出現(xiàn)和增多與特殊顆粒的出現(xiàn)和增多有平行關系。單核細胞系：原單呈陰性反應，幼單和單核細胞呈弱陽性反應。陽性顆粒少而細小，彌散分布，有的也可呈陰性反應。其他細胞：淋巴細胞、巨核細胞、血小板、幼紅細胞、漿細胞和組織細胞均呈陰性反應。有的吞噬細胞可呈陽性反應第11頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml?？杀４?-2年。

過氧化氫溶液配制：

3%過氧化氫1滴+蒸餾水5ml，須每次用時新鮮配制。

第13頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三染色步驟于新鮮涂片上滴加復方聯(lián)苯胺染液3－8滴，使涂片蓋滿。1－2分鐘后加入等量過氧化氫溶液。4－8分鐘后用水沖洗，空氣中晾干。用瑞氏染液復染，涼干后油鏡觀察。第14頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三染色原理

粒細胞及部分單核細胞胞漿內(nèi)的顆粒中含有過氧化物酶，該酶能分解過氧化氫，釋放出新生態(tài)的氧。從而使無色的聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，它可進一步氧化變成棕色的化合物

第15頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三結果判斷陽性反應為藍色或藍棕色顆粒，定位于胞漿中。第16頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三臨床意義ALL時，原始細胞的POX陽性小于3%。AML時，原始細胞的陽性≥3%。在多數(shù)的M1、絕大部分M2和M3中，原始細胞的陽性率大于85%。M4和M5時，原單有時可呈弱陽性，但絕大多數(shù)的原單是POX陰性。M6，原粒和幼稚粒細胞是POX陽性，幼紅細胞是POX陰性。在M7，血小板POX的活性只能在超微結構上證實。MDS時，粒細胞白血病和感染所致的WBC增高時，成熟中性粒細胞的POX活性可能降低或消失。CML時，成熟中性粒細胞的POX活性增強。第17頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三

注意事項

已固定的血膜因為酶已破壞不能再作過氧化物酶染色。所用過氧化氫必須新鮮，加于血膜上應能發(fā)生泡沫。過量時紅細胞可出現(xiàn)假陽性。過氧化氫的濃度要適當加減，過量則顆粒色深，不足則顆粒色淡。滴加過氧化氫液之后，最好將染片置于載物臺上，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胞漿出現(xiàn)陽性顆粒時，立即水洗。第18頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第19頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）第20頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三目的

紅白血?。?+++）與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷MDS與巨幼紅細胞貧血（-）的鑒別診斷單核細胞白血?。?）與組織細胞?。∕H）的鑒別診斷淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細胞白血病的鑒別診斷高歇病與尼曼-匹克病的鑒別診斷

以上都是前者增高，后者降低或陰性。

第21頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑

-110g/L過碘酸液Schiff染液：堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入堿性品紅，振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解，冷至50℃加入1M的鹽酸20ml，混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g，混合，置于帶塞的棕色瓶中，放于暗處24小時。染液為無色，如為微紅則加活性炭1－2g，混合過濾，如過濾液仍有紅色，應再加少許活性炭，至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶內(nèi)保存在冰箱備用，如變?yōu)榧t色，則不能使用。

第22頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑-2

蘇木素液：蘇木素0.9g95％乙醇10ml

銨（鉀）明礬20gDH2O200ml

將蘇木素溶于95％的乙醇，鉀明礬溶于水（可加熱），然后將蘇木素液加入明礬液中混合，用強火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速攪拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日過濾，臨用時取此液95ml加冰醋酸5ml，可使細胞著色清楚。

第23頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三染色步驟

將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。10g/L過碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘，晾干Schiff染液，60分鐘用自來水洗滌15分鐘（細水長流沖洗）蘇木素染液10分鐘。自來水沖洗15分鐘，待干鏡檢。

第24頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三染色原理

過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結合，呈紅色，定位于胞漿上。

第25頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三結果判斷

正常BM：有核紅細胞幾乎均呈陰性反應，在AML－M6，幼紅細胞為PAS強陽性。中性粒細胞：原粒細胞多為陰性，早幼粒階段開始呈PAS陽性，其后各階段陽性逐漸增強。巨核細胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核細胞為細小彌散的陽性，PLT為粉紅色。ALL：可以是密集粗塊狀的顆粒，也能是細小彌散的顆粒，或是這兩種顆粒的混合。ALL的PAS也可能為陰性，特別是L3時。單核細胞白血病，原單細胞常為陰性，幼單和成熟單可有弱陽性或彌散陽性。

第26頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三注意事項

1）

Schiff液變紅不能再用。2）

堿性品紅的質(zhì)量很重要，如堿性品紅不合格，加活性炭，顏色也不被吸附。如無蘇木精復染液，可用1%甲綠復染25分替代。

第27頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第30頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三非特異性酯酶染色第31頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三原理

非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪的酶，當酯酶活性存在時，水解基質(zhì)中的α－醋酸萘酚，與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有機產(chǎn)物，定位于胞漿上。第32頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑甲醛：基質(zhì)液：

1/15M的磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮鹽（DiazoblueB）40mg第33頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三方法

新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘，晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時，水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復染20－30分鐘。水洗，晾干，鏡檢。第34頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三臨床意義

單核細胞系統(tǒng)呈陽性，伴隨著細胞的成熟而加強，對AL有鑒別診斷作用。第35頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗同非特異性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化鈉，即可抑制單核細胞的酯酶，故可作急性單核細胞白血病的鑒別診斷。

第36頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三急性白血病中的組化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始細胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原單細胞）

—

M5—/+++—/+

M6+（原粒細胞）

—+（幼紅細胞）

M7—++第40頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三

中性粒細胞堿性磷酸酶染色（AKP）

第41頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三目的鑒別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻b別淋巴肉瘤（高）和何杰金病鑒別細菌性感染（高）與病毒性感染

第42頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三分布

血細胞的堿性磷酸酶活性，主要見于成熟的中性粒細胞，定位于胞漿中。

第43頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三原理

細胞中的AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中的磷酸萘酚鈉水解，釋放出萘酚。后者與一種穩(wěn)定的重氮鹽（常用有固紫Fast--Garnet，GBC或固藍RR）偶聯(lián)，生成不溶性的偶氮染料，沉積于細胞上。

第44頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑

95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻，冰箱保存1%甲基綠

第45頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三染色步驟

新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻，立即滴加數(shù)滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖

放入1%甲綠中復染5分鐘用蒸餾水快沖，待干，鏡檢

第46頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三結果判斷

陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細胞胞漿內(nèi)。

計數(shù)方法，按堿酶活性強弱，分為0-4+共5級。分數(shù)特點

0胞漿內(nèi)無紅色的顆粒

1彌散的紅色，偶見顆粒

2彌散的紅色，有中等量的顆粒

3顯著的紅色，有較多的顆粒

4顯著的紅色，有充滿胞漿的粗大顆粒第47頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三計算積分分數(shù)細胞數(shù)目積分

0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分

第48頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三臨床意義

正常的LAP積分是20－100分，但因為計數(shù)的主觀性，很重要的是建立每個實驗室自己的正常值。臨床診斷積分正常20－100CML＜13

類白血病＞100

真紅100－200

繼發(fā)性紅細胞增多10－100

第49頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三第50頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三鐵粒染色第51頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三原理

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離出來，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍反應。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應的強弱了解骨髓中鐵的含量。

第52頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三試劑

酸性亞鐵氰化鉀溶液：

200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩加入濃鹽酸，邊滴加邊搖勻，至出現(xiàn)白色沉淀，再滴加200g/L亞鐵氰化鉀，邊滴加邊搖勻，至白色沉淀消失為止，備用。2g/L核固紅－硫酸鋁溶液：取硫酸鋁10g加入100mlDH2O再加入核固紅EMER出品0.2g，置于37℃水浴中1小時，并經(jīng)常振蕩，使溶解，過濾后使用。第53頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三方法選骨髓小粒豐富的骨髓涂片玻片上滴加酸性亞鐵氰化鉀，染色30分鐘。（可置于37℃）用DH2O沖洗后用核固紅染液復染10－15分鐘。流水沖洗，晾干，油鏡檢查。第54頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三結果

正常人細胞外鐵：＋－＋＋幼紅細胞呈鮮紅色，胞漿成淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。細胞外鐵的判斷用低倍鏡觀察涂片，特別時涂片尾部和骨髓小粒附近。第55頁，講稿共65頁，2023年5月2日，星期三細胞外鐵判斷標準－無顆