酶的生產(chǎn)課件

關(guān)于酶的生產(chǎn)第1頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三酶的來源

酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中。最早人們從動(dòng)植物組織中提取酶，例如用動(dòng)物胰臟和麥芽提取淀粉酶，從動(dòng)物胃膜、胰臟、木瓜和菠蘿中提取蛋白酶。隨著酶制劑應(yīng)用的日益廣泛，目前工業(yè)上應(yīng)用的酶大都來自微生物，這是因?yàn)槲⑸锓N類多，幾乎所有的酶都能從微生物中找到，而且它的生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地域的限制。由于微生物容易培養(yǎng)，繁殖快，產(chǎn)量高，故可在短時(shí)間內(nèi)廉價(jià)地大量生產(chǎn)。第2頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三對(duì)生產(chǎn)菌的要求（1）不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)生上與病原體無關(guān)，也不產(chǎn)生毒素。這一點(diǎn)對(duì)食品用酶和醫(yī)藥用酶尤為重要。在采用新的產(chǎn)酶菌株時(shí)，一般應(yīng)先有大量的病理、毒理或動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為依據(jù)?，F(xiàn)在已經(jīng)過某些國家和國際機(jī)構(gòu)鑒定、審核后認(rèn)為可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)菌有：枯草桿菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。第3頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三對(duì)生產(chǎn)菌的要求（2）不易變異退化，不易感染噬菌體。（3）產(chǎn)酶量高，酶的性能符合應(yīng)用需要，而且最好是產(chǎn)胞外酶的菌株。（4）能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，容易培養(yǎng)。

第4頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三一、菌種的分離、篩選

菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良的菌種不僅能提高酶制劑的產(chǎn)量、發(fā)酵原料的利用效率，而且還與增加品種、縮短生產(chǎn)周期，改進(jìn)發(fā)酵和提煉工藝等密切相關(guān)。

自然界是菌種的主要來源。工業(yè)生產(chǎn)用的產(chǎn)酶菌種，最初都是由自然界中分離篩選，或從現(xiàn)有保藏菌種中篩選出來的。第5頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三一些工業(yè)用酶的產(chǎn)生菌的來源第6頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三1

含菌樣品的采集

要分離某種酶的產(chǎn)生菌，必須事先進(jìn)行分析，有選擇地采集樣品進(jìn)行分離。例如到堆積腐爛纖維素的地方去取樣，分離產(chǎn)纖維素酶的菌；在谷物表面采樣以分離淀粉酶產(chǎn)生菌；柚苷酶的產(chǎn)生菌常附著在葡萄果實(shí)上。有時(shí)候?yàn)榱朔蛛x一些被認(rèn)為在自然界分布概率不高的新酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以到該酶作用底物的某些特殊場(chǎng)所去采集樣品。如聚乙烯醇分解酶產(chǎn)生菌就是從聚乙烯醇生產(chǎn)廠的土壤中發(fā)現(xiàn)的。又如，耐熱菌可以從堆肥中和高溫溫泉噴出口處去找。第7頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應(yīng)條件

胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應(yīng)條件通常和菌的最適生長條件一致。例如，嗜堿性枯草桿菌來源的蛋白酶，其作用最適pH就比嗜中性地衣芽胞桿菌來源的蛋白酶高出幾個(gè)pH單位；同樣，從耐熱的凝結(jié)芽胞桿菌得到的α－淀粉酶，其作用的溫度范圍可比常溫淀粉液化芽胞桿菌來源的高10℃左右。但是，胞內(nèi)酶的熱穩(wěn)定性常比該菌的最適生長溫度要稍低一些，這可能和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境對(duì)酶的保護(hù)作用有關(guān)。第8頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三一般的取樣方法

如果預(yù)先不了解某種產(chǎn)酶菌的具體來源，一般可從土壤中分離，因?yàn)橥寥朗俏⑸锏拇蟊緺I。取樣時(shí)先將表土刮去2～3cm，在同一條件下選好3～5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)取土樣10g左右，混在一起包好，然后注明采樣地點(diǎn)和日期備用。第9頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三2

富集培養(yǎng)

收集到的樣品，如果含所需的菌較多，可直接進(jìn)行分離；但若所需的菌很少，就需要經(jīng)過富集培養(yǎng)，采用適合所需菌生長的最適培養(yǎng)條件，使需要的菌大量繁殖，不需要的菌不生長或少生長，以利分離篩選。例如，土壤中的根霉數(shù)量較少，而其它不需要的菌卻很多，所以可用米飯或饅頭等淀粉原料作碳源，使根霉迅速繁殖。第10頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三3

菌種篩選

所需菌在自然條件通常是與其它各種菌混在一起的，所以要進(jìn)行分離、純化，這樣才能獲得純種。純化時(shí)一般采用稀釋法或劃線法，培養(yǎng)一段時(shí)間后，得到單一菌落。霉菌多采用馬鈴薯浸汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基；細(xì)菌多采用肉湯培養(yǎng)基。第11頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三篩選方法

在篩選產(chǎn)酶菌時(shí)，一般往培養(yǎng)基中加入酶作用的底物，觀察底物變化的狀況，確認(rèn)產(chǎn)酶的菌落和產(chǎn)酶的能力。例如，在分離篩選淀粉酶的產(chǎn)酶菌時(shí)，可在瓊脂培養(yǎng)基中添加

1％的可溶性淀粉，涂布菌懸液，培養(yǎng)一段時(shí)間后，噴上稀的碘—碘化鉀溶液，產(chǎn)淀粉酶的菌落周圍就不能被染成藍(lán)色，而出現(xiàn)透明圈，透明圈越大，說明產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。同樣，在篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以往培養(yǎng)基中加入羧甲基纖維素或結(jié)晶纖維素，根據(jù)菌落周圍透明圈的大小選出產(chǎn)酶能力較高的菌株。在篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)，可加入酪蛋白，同樣也會(huì)產(chǎn)生透明圈。第12頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三篩選方法

有時(shí)，也可以用特定的顯色劑和底物或產(chǎn)物的顯色反應(yīng)來判斷菌種的產(chǎn)酶能力。上面介紹的方法是以酶能從細(xì)胞里分泌到胞外為前提的，若篩選胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌，則要用其它方法。第13頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三某些常用的篩檢細(xì)胞外酶和膜結(jié)合酶的方法第14頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三某些常用的篩檢細(xì)胞外酶和膜結(jié)合酶的方法第15頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三二、育種

篩選得到的菌株，經(jīng)過各種培養(yǎng)條件的試驗(yàn)，有些可以直接用于生產(chǎn)，也有些自然篩選的菌種產(chǎn)酶能力較低，或雖然產(chǎn)酶能力很高，但無關(guān)的酶，甚至有害的酶活性也很高，給酶的應(yīng)用帶來困難。在這種情況下，不能單是選種，還要進(jìn)行育種，即獲得突變株。目前應(yīng)用于工業(yè)酶的產(chǎn)生菌都是經(jīng)過誘變的改良菌種。第16頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三1．用物理或化學(xué)方法誘變

紫外線、X-射線、γ-射線、高能電子、快中子等。物理方法第17頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三化學(xué)誘變①誘變劑與一個(gè)或多個(gè)核酸堿基發(fā)生化學(xué)變化，使DNA復(fù)制時(shí)堿基置換而引起變異，如羥胺亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等。②誘變劑是天然堿基的結(jié)構(gòu)類似物，在復(fù)制時(shí)參入DNA分子中引起變異，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤和2-氨基嘌呤等。③誘變劑在DNA分子上減少或增加1～2個(gè)堿基，使堿基突變點(diǎn)以下全部遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致碼組移動(dòng)突變體的出現(xiàn)，如吖啶類物質(zhì)和一些氮芥衍生物（ICR）等。第18頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三誘變育種的優(yōu)點(diǎn)

誘變育種操作簡(jiǎn)便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產(chǎn)量，改進(jìn)質(zhì)量，還可擴(kuò)大產(chǎn)品品種和簡(jiǎn)化工藝條件。對(duì)于霉菌這樣的多核生物，上述方法處理效果較差，上述方法多用于核酸較少的分生孢子。第19頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三育種效果舉例1943年從自然界分離到的青霉素產(chǎn)生菌的效價(jià)只有20u/ml，經(jīng)過一系列的誘變育種后，效價(jià)已達(dá)40000u/ml。金霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，發(fā)酵液中又積累了去甲基金霉素。谷氨酸棒桿菌1299經(jīng)紫外線誘變后，有的能產(chǎn)賴氨酸，有的能產(chǎn)纈氨酸，增加了產(chǎn)品的種類。土霉素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發(fā)酵罐的利用率。第20頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三微生物酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制誘導(dǎo)（induction）末端產(chǎn)物抑制（endproductinhibition）代謝降解物抑制（cataboliteinhibition）

第21頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三誘導(dǎo)

誘導(dǎo)是指在培養(yǎng)基中有酶作用的底物或底物類似物時(shí)，酶合成可旺盛地進(jìn)行的現(xiàn)象。這種調(diào)節(jié)機(jī)制多存在于分解代謝中的酶合成，例如纖維素酶，在培養(yǎng)基中有纖維素或其衍生物存在時(shí)，酶就能合成，無此類物質(zhì)時(shí)，酶的合成幾乎不發(fā)生。第22頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三末端產(chǎn)物抑制

末端產(chǎn)物抑制常見于合成代謝中的一些酶，它是指代謝途徑的終產(chǎn)物抑制該代謝途徑中的酶合成的現(xiàn)象，象賴氨酸抑制天冬氨酸激酶的合成，蘇氨酸抑制高絲氨酸脫氫酶的合成和色氨酸操縱子（色氨酸濃度高時(shí)，色氨酸與阻遏蛋白結(jié)合，復(fù)合物阻止色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄）就是這樣。（反饋抑制）第23頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三代謝降解物抑制

代謝降解物抑制是指當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖這一類易被代謝的物質(zhì)時(shí)，而引起的酶合成抑制現(xiàn)象，這種現(xiàn)象常被稱為葡萄糖效應(yīng)。第24頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三大腸桿菌乳糖操縱子的誘導(dǎo)作用

大腸桿菌乳糖操縱子的一個(gè)調(diào)節(jié)基因lacI所編碼的阻遏蛋白所起的是負(fù)控制作用，該阻遏蛋白與乳糖操縱子的操縱區(qū)lacO結(jié)合后阻止基因轉(zhuǎn)錄；有乳糖存在時(shí)，乳糖與該阻遏蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，此復(fù)合物不能與lacO結(jié)合，基因轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行，這就是誘導(dǎo)作用。第25頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三大腸桿菌乳糖操縱子的葡萄糖效應(yīng)

大腸桿菌乳糖操縱子的另一個(gè)調(diào)節(jié)基因稱為環(huán)腺苷酸受體蛋白基因（cyclicAMPreceptorproteingene,CRP），它所編碼的CRP蛋白與cAMP相結(jié)合并以結(jié)合狀態(tài)作用于啟動(dòng)子時(shí)能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，這種基因調(diào)控屬于正控制。葡萄糖的降解物能降低細(xì)胞中的cAMP的濃度，cAMP的濃度降低后CRP蛋白便不再和它結(jié)合，從而改變構(gòu)象并失去了促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的功能。這一效應(yīng)就是葡萄糖效應(yīng)，此效應(yīng)的作用是在同時(shí)存在葡萄糖和乳糖時(shí)，優(yōu)先利用葡萄糖，而不合成吸收和分解乳糖的酶。

第26頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三誘變提高酶產(chǎn)量的原理

如果我們通過誘變把誘導(dǎo)酶產(chǎn)生菌變異成組成酶產(chǎn)生菌，那么，我們就可以通過廣泛地選擇培養(yǎng)基很容易地提高酶的產(chǎn)量。同樣，如果經(jīng)過誘變，能解除末端產(chǎn)物抑制或代謝降解物抑制，在理論上說，酶的合成就能無限制地進(jìn)行下去。第27頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三誘變后篩選

誘變?yōu)樘岣呙富钚蕴峁┝艘环N可能性，但它并沒有一條固定的規(guī)律可循，誘變操作后能否得到我們所需的高產(chǎn)菌株，還必須通過檢測(cè)來確定。在篩選誘變后的菌株時(shí)，可根據(jù)情況選擇適當(dāng)?shù)膮⒖贾笜?biāo)。第28頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三誘變后篩選舉例

芽孢桿菌屬往往都合成胞外酶，但隨著孢子的形成，酶的合成便受到阻遏。根據(jù)這一性質(zhì)，選擇不形成孢子的菌株。以這一屬中的枯草桿菌為例，孢子形成能力缺陷株對(duì)利福平表現(xiàn)出抗性，誘變后，可以用含利福平的培養(yǎng)基，挑選能生長的菌落，就能得到失去孢子形成能力的菌株。用這種菌株來產(chǎn)酶，就可以使酶合成的時(shí)間延長，從而提高酶的產(chǎn)量。第29頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三2．用雜交、體細(xì)胞融合、基因重組技術(shù)等育種

德國研究人員將大腸桿菌的青霉素?；富蛲ㄟ^質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)入到宿主大腸桿菌中，新構(gòu)建的菌種產(chǎn)酶能力比原來的約高50倍。放線菌產(chǎn)生的葡萄糖異構(gòu)酶用于高果糖漿制造業(yè)，Upjohn公司的研究人員將葡萄糖異構(gòu)酶基因連接到載體質(zhì)粒pBR322上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，表觀活力可比原株提高5倍左右。第30頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三三、產(chǎn)酶菌的培養(yǎng)

有了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，只是酶生產(chǎn)的先決條件，要有效地進(jìn)行生產(chǎn)還必須探索產(chǎn)酶菌的最適培養(yǎng)條件。首先要合理選擇好培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。在工業(yè)生產(chǎn)中還要摸索一系列工程和工藝條件，如培養(yǎng)基的滅菌方式、菌種培養(yǎng)條件、發(fā)酵罐的型式、通氣方式、攪拌速度、加溫和冷卻方法、pH調(diào)節(jié)方法等。第31頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三1．培養(yǎng)基碳源氮源無機(jī)鹽生長因素產(chǎn)酶促進(jìn)劑第32頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（1）碳源

碳是構(gòu)成菌體成分的重要元素，是細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)和各種代謝產(chǎn)物的骨架，也是微生物生長的主要能量來源。酶產(chǎn)生菌大都只是利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。工業(yè)生產(chǎn)中常用的碳源原料有甘薯、玉米、麩皮、米糠等。第33頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（2）氮源

微生物的原生質(zhì)是由蛋白質(zhì)、核酸、脂類和水等組成的，酶本身又是蛋白質(zhì)，而氮素是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，因此，在酶制劑工業(yè)中，氮源是不可缺少的重要原料。酶制劑生產(chǎn)中常用的有機(jī)氮多為農(nóng)副產(chǎn)品，如豆餅、花生餅、菜籽餅等；無機(jī)氮源常用的有硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨和磷酸氫二銨等。第34頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（3）無機(jī)鹽

微生物在生長繁殖和代謝過程中，需要多種元素，無機(jī)鹽能提供多種金屬離子和非金屬離子，常用的無機(jī)鹽有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二銨、磷酸、磷酸鉀，硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣以及鐵、錳、鋅、銅、鈷、鉬等微量元素。第35頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（4）生長因素

微生物還需要一些微量的有機(jī)物質(zhì)，才能正常地生長。這類物質(zhì)統(tǒng)稱為生長因素，其中包括氨基酸、維生素、嘌呤堿和嘧啶堿等。酶制劑工業(yè)生產(chǎn)上所需的生長因素，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、酵母膏等，它們的生長因素含量都十分豐富。目前，發(fā)酵工業(yè)廣泛采用玉米漿作為提供生長因素的原料。另外，乳酸、植酸鹽、生物素等也常用。第36頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（5）產(chǎn)酶促進(jìn)劑

在酶制劑的生產(chǎn)過程中，如果添加少量某種物質(zhì)就能顯著增加酶的產(chǎn)量時(shí)，就將這種物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。它們大都屬于酶的誘導(dǎo)物或是表面活性劑。常見的有吐溫80、脂肪酰胺磺酸鈉、聚乙烯醇、糖脂、EDTA等，它們對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)效果不一，需經(jīng)試驗(yàn)才能用于生產(chǎn)。第37頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基舉例①枯草桿菌BF7658α－淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化銨0.15%（自然pH值）。②枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%，糠1%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.03%（自然pH值）。③枯草桿菌AS1.398堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖0.4%，乳蛋白水解物0.1%，硫酸銨1%，氯化鉀0.1%，氯化鈣0.1mmol/L，氯化鎂1.0mmol/L，磷酸氫二鈉20mol/L（用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制）。第38頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基舉例④黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉6%，豆餅粉4%，玉米漿0.6%，氯化鈣0.5%，氯化銨1%，磷酸氫二鈉0.2%（pH5.5）。⑤黑曲霉AS3.396果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基

麩皮5%，果膠0.3%，硫酸銨2%，磷酸二氫鉀0.25%，硫酸鎂0.05%，硝酸鈉0.02%，硫酸亞鐵0.001%（自然pH）。⑥黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.4～5.0）。第39頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基舉例⑦地衣芽胞桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉5.5%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.03%（pH8.5）。⑧橘青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基

淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.04%，磷酸氫二鈉0.05%，磷酸二氫鉀0.05%（自然pH值）。⑨

游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基

糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0.1%，硫酸鎂0.05%（pH7.2）。第40頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三2．培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)也稱麩曲培養(yǎng)，該法是以麩皮或米糠為主要原料，另外根據(jù)需要添加適量無機(jī)鹽及其它成分，加水拌成含水約50%的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)設(shè)備簡(jiǎn)單，便于推廣，并特別適用于霉菌類的培養(yǎng)。因?yàn)榫z體在這種培養(yǎng)基中能較好地伸展、生長，產(chǎn)酶率也較高。例如，用曲霉和毛霉生產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，用青霉和曲霉生產(chǎn)果膠酶，用木霉生產(chǎn)纖維素酶等，至今許多地方仍然沿用這種方式。第41頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三固體培養(yǎng)方式

在固體培養(yǎng)中，最簡(jiǎn)單的是淺盤培養(yǎng)（trayculture），培養(yǎng)基厚度一般不超過5cm。其次是轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)（rotatingdrumculture），培養(yǎng)基量大，培養(yǎng)過程中借助轉(zhuǎn)鼓不停地翻動(dòng)，以利充分通氣。近年來則多用通風(fēng)式厚層培養(yǎng)（highheapcultureordeepculture），培養(yǎng)基厚度可達(dá)20～30cm，通過送風(fēng)輸氧。第42頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三固體培養(yǎng)法的缺點(diǎn)

物料利用不完全，勞動(dòng)強(qiáng)度大外，易染菌等。不少缺點(diǎn)是由麩皮的物理性質(zhì)引起的，麩皮導(dǎo)熱性差，隨著微生物的大量繁殖，積蓄的熱量不能順利發(fā)散，造成麩皮溫度上升，反過來抑制微生物生長繁殖；麩皮通氣性差，當(dāng)麩皮達(dá)到一定厚度時(shí)，造成內(nèi)部嫌氣狀態(tài)，從而抑制所需微生物的繁殖。此外，對(duì)培養(yǎng)中的溫度、pH變化、細(xì)胞增殖、培養(yǎng)基原料消耗及成分變化等檢測(cè)十分困難，不能像液體培養(yǎng)那樣進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)。第43頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（2）液體培養(yǎng)法

液體培養(yǎng)法的工藝特點(diǎn)是利用液體培養(yǎng)基，進(jìn)行微生物的生長繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣（供氧）方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)兩種，其中深層通氣培養(yǎng)是目前應(yīng)用最廣的方法。我國的抗菌素發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵、氨基酸和核苷酸發(fā)酵、酶制劑發(fā)酵均采用此法，而液體表面培養(yǎng)法實(shí)際上已被淘汰了。第44頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三液體培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)

液體培養(yǎng)法的培養(yǎng)基成分、通氣攪拌條件、培養(yǎng)基的pH等都可在培養(yǎng)過程中人為加以控制。采用液體培養(yǎng)法可以通過對(duì)產(chǎn)酶過程的控制來大幅度地增加酶的產(chǎn)量。液體培養(yǎng)的各項(xiàng)最適條件可通過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)獲得。第45頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三3．影響酶生產(chǎn)的一些因素溫度pH值通氣（供氧）攪拌泡沫誘導(dǎo)劑和抑制劑表面活性劑

第46頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（1）溫度

在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被合成為菌體的組成成分和酶，作為合成代謝的生化反應(yīng)屬于吸熱反應(yīng)；而菌體生長時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量分解，這種分解代謝的生化反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，分解反應(yīng)放出的熱量大于合成反應(yīng)吸收的熱量，這時(shí)發(fā)酵液的溫度就會(huì)上升，加上攪拌產(chǎn)生的機(jī)械熱，發(fā)酵液溫度可能較高，因此必須降溫，這樣才能保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適當(dāng)溫度。第47頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三變溫培養(yǎng)

各種微生物對(duì)培養(yǎng)溫度要求不同。例如，枯草桿菌（A.S.1398）進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，要求培養(yǎng)溫度前期有個(gè)升溫階段，即從31℃逐步升至41℃，然后冷至31℃進(jìn)行發(fā)酵，這樣可大量積累酶。嗜熱芽孢桿菌在55℃發(fā)酵所產(chǎn)生的α－淀粉酶的穩(wěn)定性比在35℃發(fā)酵時(shí)好。實(shí)踐表明，一般發(fā)酵溫度比菌種培養(yǎng)時(shí)略高一些對(duì)產(chǎn)酶有利。第48頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（2）pH值

各種微生物都需要在一定的pH環(huán)境中才能正常生長，如果pH不適，不但妨礙菌體生長，還會(huì)改變微生物的代謝途徑和產(chǎn)物的性質(zhì)。各類微生物對(duì)pH的要求不同，一般霉菌和酵母菌要求pH4～6，細(xì)菌和放線菌要求pH7左右。第49頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基成分與pH的關(guān)系

在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵液的pH不斷變化。一般來說，如果培養(yǎng)基成分中C／N值高者，發(fā)酵液傾向于酸性；C／N值低者，發(fā)酵液傾向于中性或堿性。pH還與通氣有關(guān)，如果通氣不足，糖和脂肪的氧化不完全，則會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸類中間產(chǎn)物，使得培養(yǎng)基的pH出現(xiàn)不同程度的下降。

第50頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三pH的控制方法

控制發(fā)酵液的pH通?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，掌握原料的配比，保持一定的C／N比，或者添加緩沖劑使發(fā)酵液具有一定的緩沖能力，也可以通過調(diào)節(jié)通氣量來實(shí)現(xiàn)。在特殊情況下，當(dāng)pH過高時(shí)，可加入糖或淀粉調(diào)節(jié)，pH過低時(shí)，可加入氨來調(diào)節(jié)。第51頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三pH與產(chǎn)酶的關(guān)系

有些微生物可以同時(shí)產(chǎn)生幾種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。例如，黑曲霉可以生產(chǎn)α－淀粉酶，也可以生產(chǎn)糖化酶，在培養(yǎng)基的pH值為中性范圍時(shí)，α－淀粉酶的產(chǎn)量增加，而糖化酶減少；反之在培養(yǎng)基的pH值偏向酸性時(shí)，則糖化酶的產(chǎn)量提高，而α－淀粉酶降低。再如，采用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為堿性時(shí)，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶；當(dāng)培養(yǎng)基的pH為中性時(shí)，主要生產(chǎn)中性蛋白酶；而在酸性條件下，則以生產(chǎn)酸性蛋白酶為主。第52頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（3）通氣（供氧）

各種微生物對(duì)氧的需要量是不同的，用于酶制劑生產(chǎn)的微生物基本上都是好氣性的。氧的攝取量多少以微生物的呼吸強(qiáng)度表示，增加周圍環(huán)境中的氧，可以加強(qiáng)微生物的呼吸強(qiáng)度，但到一臨界值為止，此臨界值稱為該微生物的臨界氧濃度，供氧的多少就根據(jù)此值來定。供氧過少，則達(dá)不到臨界氧濃度而抑制微生物的正常生長；供氧過多不僅造成浪費(fèi)，而且還可能會(huì)改變代謝途徑。為了精確測(cè)定培養(yǎng)液中的氧濃度，現(xiàn)在普遍采用溶氧儀。第53頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（4）攪拌

好氣性微生物在液體深層發(fā)酵中除不斷通氣外，還需攪拌。攪拌能將氣泡打碎，增加氣液接觸面積，加速氧的溶解。攪拌還可以加強(qiáng)液體的湍流，有利于熱交換以及營養(yǎng)物質(zhì)與菌體的均勻接觸，同時(shí)稀釋菌體周圍的代謝產(chǎn)物，有利于促進(jìn)微生物的新陳代謝。第54頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（5）泡沫

酶制劑發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫一般較多，這是由于發(fā)酵液受到強(qiáng)烈的通氣攪拌及代謝中產(chǎn)生的氣體所形成的，而且產(chǎn)生的氣泡不易消失，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的蛋白質(zhì)分子排在氣泡表面形成一層膜，降低了界面的表面張力。第55頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三泡沫的害處

泡沫的存在會(huì)阻礙CO2的排除，直接影響氧的溶解，從而影響微生物的生長和產(chǎn)物的形成。同時(shí)，泡沫層過高，往往造成發(fā)酵液隨泡沫溢出罐外，不但浪費(fèi)原料，還易引起染菌。又因泡沫上升，發(fā)酵罐裝料受到限制，降低了發(fā)酵罐的利用率。因此，必須采取消泡措施。第56頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三消泡

除用機(jī)械力消泡外，還常用消泡劑消泡。常用的消泡劑有：天然油類（包括礦物油類）、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、磷酸酯類、金屬皂類和聚硅氧烷等，其中以聚二甲基硅氧烷為最理想的消泡劑。我國酶制劑工業(yè)中常用的消泡劑為甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）和泡敵（聚環(huán)氧丙烷環(huán)氧乙烷甘油醚）。第57頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（6）誘導(dǎo)劑和抑制劑

若所生產(chǎn)的酶是誘導(dǎo)酶，則必須加入誘導(dǎo)劑，用白地霉合成脂肪酶就是一個(gè)典型的例子。在由蛋白胨、葡萄糖和少量無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基中加入橄欖油，它就能產(chǎn)生脂肪酶。誘導(dǎo)劑的作用還與添加誘導(dǎo)劑時(shí)的菌齡有關(guān)，在培養(yǎng)8小時(shí)后添加橄欖油效果最好；而在培養(yǎng)23小時(shí)，甚至更長時(shí)間后添加，則幾乎不產(chǎn)酶。第58頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三用酶活性抑制劑促進(jìn)酶形成

在多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑S-AI，能增加β－淀粉酶的產(chǎn)量。S-AI是由淀粉酶鏈霉菌產(chǎn)生的α－淀粉酶和糖化酶的特異抑制劑。如果把它添加到生長達(dá)最高峰的多粘芽孢桿菌的培養(yǎng)液中（10μg/ml），則β－淀粉酶的產(chǎn)量要比不添加時(shí)高2～3倍。把納尼科鏈霉菌產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑乙酰纈氨酰-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸添加到枝孢霉的培養(yǎng)液中（60μg/ml），則酸性蛋白酶的產(chǎn)量約增加2倍。盡管這種作用的機(jī)制還不清楚，但抑制劑對(duì)酶形成的促進(jìn)作用是值得重視的。第59頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（7）表面活性劑

代氏根霉產(chǎn)生脂肪酶，在該菌培養(yǎng)80小時(shí)后，菌體量達(dá)到最高值，可是分泌到培養(yǎng)液中的脂肪酶卻很少，可見該酶在合成后并不馬上分泌到胞外來，而是停留在胞內(nèi)。這種現(xiàn)象在米曲霉產(chǎn)生淀粉酶，白地霉產(chǎn)生脂肪酶時(shí)都能看到。在培養(yǎng)液中添加一些表面活性劑可以促進(jìn)這類分泌性酶盡快排到細(xì)胞外。常用的表面活性劑是吐溫80（Tween80）和曲拉通-X（Triton-X）。例如，用爪哇真青霉生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，若添加0.1％的吐溫80，則纖維素酶的產(chǎn)量可提高4倍以上。第60頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三4.酶生物合成的模式

細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、旺盛生長期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段。通過比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系，可以把酶生物合成的模式分為4種類型，即同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型

第61頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三酶生物合成的四種模式第62頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（1)同步合成型

此類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。酶的生物合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成也隨著停止。大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按此模式合成。該類型酶的生物合成可以由其誘導(dǎo)物誘導(dǎo)生成，但不受分解代謝物的阻遏作用，也不受產(chǎn)物的反饋抑制作用。第63頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三同步合成的機(jī)理

研究表明，同步合成型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定，其壽命一般只有幾十分鐘。在細(xì)胞進(jìn)入生長平衡期后，新的mRNA不再生成，原有的mRNA被降解后，酶的生物合成隨即停止。第64頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（2）延續(xù)合成型

此型酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長的時(shí)間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。第65頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（3）中期合成型

酶在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。中期合成酶的共同特點(diǎn)是，酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋抑制或分解代謝物的抑制作用，而酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性較差。第66頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三（4）滯后合成型

滯后合成型又稱為非生長偶聯(lián)型。此類型酶是在細(xì)胞生長一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。第67頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三滯后合成的機(jī)理

滯后合成型之所以要在細(xì)胞生長一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。第68頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三四、酶制劑的工業(yè)提取法

工業(yè)提取法是指工業(yè)上大批量提取酶的常用方法。工業(yè)上用的酶制劑，一般是用量大，純度要求不高。至于生化研究用酶，則要求特別高的純度。用途不同，質(zhì)量要求也不同，其提取方法也有明顯不同。工業(yè)酶制劑的形式有兩種：液體酶制劑和粉劑。第69頁，講稿共78頁，2023年5月2日，星期三1．發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾

發(fā)酵液中除酶及代謝產(chǎn)物外，還存在著大量的菌體以及培養(yǎng)基殘?jiān)?。若不?jīng)過預(yù)處理就談不上任何程度的純化。

預(yù)處理的目的主要有三個(gè)：1.改變懸浮液中固體粒子的物理特性，如提高硬度，加大顆粒尺寸，改變其表面類型等。2.使某些可溶的膠粘物質(zhì)變成不可溶。3.改變液體的某些物理性質(zhì)，如降低粘度和密度。

第70頁，講稿共78頁，2023年5月2日，