酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件

關于酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交第1頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與第2頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

反式轉錄激活因子

結構上是組件式的，即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA結合結構域(DNAbindingdomain，簡稱為BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，簡稱為AD)。

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這兩個結合域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的轉錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。

第4頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三酵母雙雜交第5頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件

報道株指經改造的、含報道基因(reportergene)的重組質粒的宿主細胞。

最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株具有許多優(yōu)點:

〈1〉易于轉化、便于回收擴增質粒。

〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。

〈3〉酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合第6頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三根據這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質Baitprotein的基因構建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在

AD-LIBRARY表達載體上,在酵母中表達兩者的融合蛋白。第7頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結合結構域和GAL4激活結構域就會相互作用，從而激活lacZ報道基因的表達。所以我們可以通過轉化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

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第10頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。

第11頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三綜上：酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來捕獲新的蛋白質，其大致步驟為:

1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結合域融合，構建成誘餌質粒。

2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉錄激活域融合，構建成文庫質粒。第12頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三3、將這兩個質粒共轉化于酵母細胞中。4、酵母細胞中，已分離的DNA結合域和轉錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質。第13頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

酵母雙雜交系統(tǒng)的應用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質和蛋白質的新功能當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。第14頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

2、利用酵母雙雜交在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用。而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。

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3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關。研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復制，從而達到治療這種疾病的目的。

第16頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖

眾多的蛋白質之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調和控制的?；蚪M中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義第17頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展出了

酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結構和位點。第18頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

酵母單雜交技術最早是從酵母雙雜交技術發(fā)展而來，酵母雙雜交技術通過對報告基因的表型進行檢測以實現(xiàn)對蛋白質間相互作用的研究，而酵母單雜交技術則通過對報告基因的表型檢測，分析DNA、蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內的基因表達調控。第19頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

原理用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉錄因子。研究表明GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)；而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用。據此，我們可將GAL4的DNA結合結構域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉錄。第20頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉錄激活域融合表達的cDNA文庫質粒；(2)含有目的基因和下游報告基因的報告質粒.

首先將報告質粒整合入酵母基因組,產生帶有目的基因的酵母報告株;

再將文庫質粒轉化入報告株;

若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用,可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來.第21頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細胞的GAL4蛋白調節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉錄的特點。GAL4蛋白具有兩個可分離的功能區(qū)，N端是DNA結合結構域，C端為轉錄激活結構域。只要這兩個相對獨立的結構域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價結合也可激活轉錄，這為研究蛋白質與其他分子的相互作用提供了可能。第22頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

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上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動子調控下游LacZ基因和His3基因的表達，而lexA啟動子的激活取決于DNA結合結構域和轉錄激活結構域能否在空間上相互靠近。其中第一個融合蛋白由兩部分組成，一部分為能結合lexA啟動子的DNA結合結構域，另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個融合蛋白也由兩部分組成，一部分為能激活lexA啟動子的轉錄激活結構域，另一部分為有待研究的RNA結合蛋白“Y”。第24頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三

這兩個融合蛋白通過第三個融合的RNA分子相連，其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結合位點的MS2RNA，另一端為有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個復合物形成一個功能性的轉錄