乙肝病毒的變異及臨床意義

乙肝病毒的變異及臨床意義第1頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎以及相關(guān)的肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝功能衰竭是全球范圍內(nèi)重要的醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。抗病毒治療是這一類慢性肝病的根本治療方法。干擾素α和核苷（酸）類似物（NA)是兩類主要的抗病毒治療藥物。但長(zhǎng)期使用NA，耐藥是一個(gè)突出的問(wèn)題。所以，認(rèn)識(shí)耐藥、防范耐藥具有重要的臨床意義。第2頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、乙肝病毒的研究簡(jiǎn)史二、乙肝病毒的結(jié)構(gòu)及復(fù)制三、病毒變異:S、C、P、X區(qū)四、病毒耐藥的概念和危害五、常用抗病毒藥的耐藥位點(diǎn)六、預(yù)防和監(jiān)測(cè)第3頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、乙肝病毒的研究簡(jiǎn)史1965年Blumberg發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原1967年發(fā)現(xiàn)其與肝炎相關(guān)，稱為肝炎相關(guān)抗原1970年Dane發(fā)現(xiàn)HBV完整顆粒1972WHO將澳大利亞抗原命名為乙型肝炎表面抗原（HBsAg)1979年Galibert完成了HBV全基因測(cè)序

HBsAg的發(fā)現(xiàn)曾獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第4頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、乙肝病毒的結(jié)構(gòu)及復(fù)制乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，HBV基因組由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成，長(zhǎng)的為負(fù)鏈、短的為正鏈，負(fù)鏈含3200bp，正鏈長(zhǎng)度約為負(fù)鏈的50-80%。第5頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HBV有四個(gè)ORF均位于負(fù)鏈，分別稱作s區(qū)、C區(qū)、X區(qū)和P區(qū)，分別編碼外膜蛋白、核心蛋白、X抗原和DNA多聚酶。第7頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HBV進(jìn)入肝細(xì)胞后，病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)換成cccDNA(共價(jià)閉合環(huán)狀DNA),以此為模板，轉(zhuǎn)錄成四種HBVRNA,其中只有3.5kb的mRNA含病毒DNA序列上的全部遺傳信息，因此也稱為病毒前基因組RNA。它與病毒聚合酶一起被核殼蛋白包裹，包裝成病毒核心。在病毒核心內(nèi)的前基因組RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈DNA，再以負(fù)鏈為模板合成正鏈DNA，一部分再進(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充消耗的cccDNA,另外一部分則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配包膜，形成成熟的病毒顆粒向細(xì)胞外分泌。第8頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HBV病毒顆粒感染肝細(xì)胞及DNA復(fù)制過(guò)程第9頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月慢性活動(dòng)型乙肝患者肝細(xì)胞每天可以產(chǎn)生1013個(gè)HBV顆粒，在外周血中濃度可達(dá)1012/ml，半衰期1～1.2d。被HBV感染的肝細(xì)胞半衰期為10天~100天不等。肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA半衰期較長(zhǎng)，根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，排除宿主的特異性免疫反應(yīng)以及病毒變異的影響，需要進(jìn)行14年的抗病毒治療才能完全清除患者肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA。目前無(wú)藥物可作于cccDNA,其穩(wěn)定存在是HBV不能根治的原因。

第10頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、病毒變異病毒變異是生物遺傳進(jìn)化的必然，乙型肝炎病毒(HBV)變異是在慢性感染過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而自然發(fā)生的。在外來(lái)壓力的作用下，HBV常發(fā)生選擇性變異，一些特異性HBV突變株被選擇出來(lái)。HBVDNA每個(gè)復(fù)制循環(huán)中每10000個(gè)堿基對(duì)可發(fā)生1個(gè)核苷錯(cuò)誤，每天產(chǎn)生3.2×1010個(gè)點(diǎn)突變。HBV逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中缺乏校正機(jī)制是HBV容易耐藥的根本原因。第11頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、S基因區(qū)變異

S基因區(qū)可分為：前S1、前S2和S區(qū)，分別編碼preS1、preS2和HBsAg。前S蛋白免疫原性很強(qiáng)，可與肝細(xì)胞的受體結(jié)合，是HBV具有嗜肝性的重要原因。由于S基因編碼HBsAg，所以其變異會(huì)產(chǎn)生如下不良臨床結(jié)果：第12頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(1)HBsAg陰性的乙肝病毒感染：S基因變異后所表達(dá)的HBsAg不能被現(xiàn)在的普通檢查方法檢測(cè)到，致使乙肝病毒仍然存在，卻不被發(fā)覺(jué)。對(duì)這種情況，應(yīng)該結(jié)合HBeAg檢查和乙肝病毒的基因檢查技術(shù)，方可得出正確的結(jié)果。

(2)免疫預(yù)防失?。菏褂靡岸局闔BsAg制備的血源性或基因過(guò)程乙肝疫苗所產(chǎn)生的抗HBs對(duì)一些變異株的HBsAg的親和力和中和作用明顯下降，從而可使乙肝疫苗阻斷母嬰傳播和乙肝免疫球蛋白預(yù)防移植肝再感染乙肝病毒失敗。

第13頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)致病性的改變：S基因變異株在乙肝病毒無(wú)癥狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化和肝癌患者體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，使病變程度加重，范圍增加。

(4)HBsAg亞型的改變：由于核苷酸序列發(fā)生變異，會(huì)引起HBsAg亞型的改變，使病情復(fù)雜化。第14頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月總之———S基因變異是疫苗免疫失敗的重要原因S基因變異后免疫球蛋白將不能發(fā)揮保護(hù)作用逃避干擾素治療和宿主免疫清除S基因變異是形成HBsAg陰性、抗HBs陽(yáng)性、HBV-DNA持續(xù)陽(yáng)性的慢性乙型肝炎的重要原因第15頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、前C/C基因變異

C1896位(A83)的變異：是HBV中最常見(jiàn)的變異。nt1896G-A，使28位的色氨酸（密碼子TGC）變異為終止密碼TAC，導(dǎo)致前C蛋白的翻譯終止，從而使eAg不能合成。此突變有助于HBV逃避免疫攻擊但它并不影響HBV復(fù)制，而形成慢性感染狀態(tài)。這種情況臨床上表現(xiàn)為HBeAg(-)、HBV-DNA(+)。

上述變異也見(jiàn)于干擾素治療后，因此提示以HBeAg轉(zhuǎn)陰作為疾病好轉(zhuǎn)的指標(biāo)有時(shí)并不準(zhǔn)確，應(yīng)結(jié)合HBVDNA檢測(cè)判斷。

第16頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月前C區(qū)/C區(qū)突變檢測(cè)的臨床意義判斷e抗原下降代表病毒復(fù)制能力下降的診斷是否可靠判斷乙肝病毒是否為特殊的e抗原陰性病毒類型慢性重癥肝炎、肝硬化失代償、原發(fā)性肝癌與C區(qū)位點(diǎn)突變有關(guān)對(duì)判斷疾病預(yù)后,調(diào)整抗病毒治療方案具有一定的參考價(jià)值

是否是真的血清學(xué)轉(zhuǎn)換C區(qū)變異使得細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL）效應(yīng)降低第17頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、X基因突變

X基因突變編碼154個(gè)氨基酸的X蛋白，X蛋白可激活乙肝病毒基因的復(fù)制過(guò)程，是乙肝病毒基因組內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能重疊最明顯的區(qū)域。因此，X基因在乙肝病毒復(fù)制、表達(dá)及致病中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)乙肝病毒X基因變異及其產(chǎn)物HBxAg與乙肝病毒的致癌密切相關(guān)。第18頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、P基因變異

P基因主要編碼DNA多聚酶，是最長(zhǎng)的開(kāi)放讀框，與C、S與X基因重疊。該基因共分成5個(gè)區(qū)(A、B、C、D和E)。這些區(qū)域是較保守的，參與核苷酸或模板結(jié)合，并且具有催化活性。近10多年來(lái)，在用核苷類藥物治療患者中，出現(xiàn)了P基因突變，體內(nèi)外試驗(yàn)表明這些突變株與藥物耐藥相關(guān)。

第19頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、病毒耐藥的概念和危害在核苷(酸)類似物治療過(guò)程中，從病毒變異到臨床耐藥是一個(gè)逐漸發(fā)生的過(guò)程。最初，體內(nèi)可能有少量變異的病毒株。盡管這些病毒對(duì)藥物抵抗力強(qiáng)，但其復(fù)制數(shù)量比野生病毒株少。因此，體內(nèi)的野生病毒株仍占“優(yōu)勢(shì)”，但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，野生病毒株被藥物抑制住以后，耐藥的變異病毒株被“篩選”出來(lái)，得到復(fù)制的機(jī)會(huì)，并逐漸增多，成為體內(nèi)的“優(yōu)勢(shì)”株，這時(shí)便出現(xiàn)耐藥。第20頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與DNA-P結(jié)合抑制HBV-DNA復(fù)制核苷類似藥物的作用機(jī)制第21頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖.抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥第22頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為了準(zhǔn)確地反映這種病毒變異到臨床耐藥的過(guò)程，我們把病毒變異后的耐藥分為基因耐藥、病毒學(xué)耐藥和臨床耐藥三個(gè)階段——基因耐藥：在抗病毒治療過(guò)程中體內(nèi)乙肝病毒基因組產(chǎn)生了變異，形成新的耐藥性病毒基因序列，對(duì)藥物易感性降低，但這種耐藥病毒株在體內(nèi)的量很少，只能通過(guò)病毒基因的檢測(cè)查到變異病毒株。*（表型耐藥）第23頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒學(xué)耐藥：在基因耐藥的基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)展，變異病毒株逐漸增多，HBVDNA水平反彈，一般在(1×103)～(1×106)拷貝/毫升之間，還沒(méi)有造成肝功能異常和明顯的肝臟組織學(xué)損傷。病毒學(xué)耐藥也稱為病毒學(xué)反彈。2006年美國(guó)NIH會(huì)議建議其定義為：治療后達(dá)到應(yīng)答，但在繼續(xù)治療過(guò)程中HBVDNA比達(dá)到的最低值一致性地超過(guò)1log10拷貝/ml時(shí)，稱為病毒學(xué)反彈。臨床耐藥：病毒學(xué)耐藥繼續(xù)發(fā)展，HBVDNA水平上升至1×106拷貝/毫升以上，最終出現(xiàn)ALT升高、肝臟組織學(xué)損傷，并可能有臨床癥狀。第24頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒耐藥對(duì)臨床的影響耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物選擇減少耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處病毒反彈,血清轉(zhuǎn)氨酶升高,HBeAg血清轉(zhuǎn)換率降低肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高公共衛(wèi)生危害耐藥病毒株的傳播免疫逃逸第25頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、常用抗病毒藥的耐藥位點(diǎn)

第26頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月拉米夫定耐藥位點(diǎn)：病毒最主要的變異發(fā)生在YMDD位點(diǎn)。YMDD是4個(gè)氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)的縮寫(xiě)，這4個(gè)氨基酸位于乙肝病毒DNA聚合酶上，是拉米夫定的主要作用位點(diǎn)，最常見(jiàn)的變異是M(蛋氨酸)被V(纈氨酸)或I(異亮氨酸)取代，分別稱為YVDD或YIDD變異(即：M204V/I)。一旦發(fā)生了YMDD變異，拉米夫定對(duì)HBVDNA的抑制作用就會(huì)降低1000倍以上。當(dāng)長(zhǎng)期應(yīng)用拉米夫定時(shí)，發(fā)生YMDD變異的比率逐年增加。舉例1：略第27頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月阿德福韋耐藥位點(diǎn)：主要為N236T(蘇氨酸置換門冬酰胺)或A181/T(纈氨酸/蘇氨酸置換丙氨酸)。體外檢測(cè)，這些變異株對(duì)阿德福韋的易感性降低3～10倍，具有這些變異株的患者可伴有病毒學(xué)反彈、肝炎發(fā)作和肝功能失代償。其他的耐藥株有215、237和238位點(diǎn)變異，但需進(jìn)一步確定這種變異的臨床意義。舉例2、舉例3：略第28頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月恩替卡韋耐藥位點(diǎn)：P區(qū)的184、202和250位點(diǎn)發(fā)生氨基酸的置換變異，認(rèn)為與發(fā)生恩替卡韋耐藥有關(guān)，使其對(duì)藥物易感性降低<10倍。在原有拉米夫定耐藥患者中，病毒對(duì)恩替卡韋的感性降低8～30倍。恩替卡韋屬于高基因屏障藥物，耐藥方式：rtL180M+rtM204V耐藥位點(diǎn)再出現(xiàn)rtT184，或S202，或M250位點(diǎn)改變，也就是必須同時(shí)出現(xiàn)3個(gè)耐藥位點(diǎn)。第29頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月替比夫定耐藥位點(diǎn)：其抑制HBV復(fù)制的活力較拉米夫定強(qiáng)，但二者有交叉耐藥，對(duì)有M204I變異或L180M/M204雙重變異的拉米夫定耐藥患者，替比夫定的敏感性也同樣降低1000倍以上；但替比夫定對(duì)單獨(dú)M204變異株仍有抑制作用，其易感性僅降低1～2倍。對(duì)阿德福韋耐藥株A181的易感性降低3～5倍，但對(duì)N236T變異株仍敏感。第30頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以上可以看出，拉米夫定、替比夫定有交叉耐藥性，恩替卡韋與前兩者有部分交叉耐藥性，而阿德福韋的耐藥位點(diǎn)獨(dú)特，與以上三種藥物均無(wú)交叉耐藥性。第31頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月干擾素治療對(duì)HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。近來(lái)對(duì)前C區(qū)基因變異的研究顯示，干擾素治療并不增加前C區(qū)基因變異的機(jī)會(huì)，前C區(qū)終止變異也不影響干擾素治療應(yīng)答，但在干擾素治療過(guò)程中產(chǎn)生前C區(qū)變異往往可預(yù)示病毒清除失敗。出現(xiàn)機(jī)體耐藥可能與中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)。

第32頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒對(duì)不同抗病毒藥物的“基因屏障”是不同的，因此藥物的耐藥發(fā)生率也不同。所謂病毒對(duì)藥物的基因屏障是病毒變異或逃逸藥物選擇造成病毒耐藥的閾概率。有高耐藥基因屏障的藥物，病毒耐藥的危險(xiǎn)性較低；而低耐藥基因屏障的藥物，病毒耐藥的危險(xiǎn)性較高。第33頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖2.各種抗病毒藥物的耐藥發(fā)生率第34頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、預(yù)防和監(jiān)測(cè)抗病毒治療期間所達(dá)到的病毒抑制程度，既是決定預(yù)后最重要的指標(biāo)，也是預(yù)測(cè)耐藥發(fā)生的好方法。近年來(lái)，路線圖的概念是為了預(yù)測(cè)療效及耐藥而提出來(lái)的。第35頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Roadmap預(yù)測(cè)的概念KeeffeEB,etal.

ClinicalGastroenterolHepatol2007;5:890–897.12周檢測(cè)最初無(wú)應(yīng)答病毒學(xué)應(yīng)答早期治療失敗依從性良好依從性不好24周檢測(cè)早期應(yīng)答PCR檢測(cè)陰性完全病毒學(xué)應(yīng)答介于≥300和<104copies/ml部分病毒學(xué)應(yīng)答≥104copies/ml病毒學(xué)應(yīng)答不好開(kāi)始治療加用第二種藥物繼續(xù)原方案治療每6個(gè)月監(jiān)測(cè)一次初始選擇低耐藥基因屏障藥物：加用不同變異位點(diǎn)的藥物初始選擇高耐藥基因屏障藥物：每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次，持續(xù)超過(guò)48周初始選擇抗病毒療效弱藥物：每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次，持續(xù)至48周48周時(shí)完全應(yīng)答，繼續(xù)治療48周時(shí)不完全應(yīng)答，加用療效更強(qiáng)并且不交叉耐藥的藥物第36頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月治療期間病人監(jiān)測(cè)的目的是評(píng)估藥物的安全性、依從性和有效性。特別是早期病毒學(xué)的應(yīng)答狀況對(duì)發(fā)現(xiàn)原發(fā)性治療失敗和預(yù)測(cè)長(zhǎng)期療效非常有價(jià)值，可以預(yù)測(cè)長(zhǎng)期治療可能發(fā)生組織學(xué)改善、減少肝病進(jìn)展和/或耐藥。第一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)是在治療12周時(shí)，如果血清HBVDNA下降小于1log10IU/ml或50copies/ml，稱為原發(fā)性治療失敗。原發(fā)性治療失敗是罕見(jiàn)的，如果不是因?yàn)椴∪艘缽男詥?wèn)題，對(duì)于原發(fā)性治療失敗的病人應(yīng)當(dāng)改變治療方案。第二個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)是治療24周時(shí)病人的血清HBVDNA水平。24周時(shí)的療效分為完全應(yīng)答、部分應(yīng)答或不充分應(yīng)答。第37頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月完全應(yīng)答的定義為：HBVDNA<60IU/ml或<300copies/ml(PCR法)。完全應(yīng)答的病人繼續(xù)服藥，延長(zhǎng)到每6個(gè)月隨訪并檢測(cè)一次。部分應(yīng)答定義為：治療24周時(shí)HBVDNA<2000IU/ml(<4log10copies/ml)。部分應(yīng)答的病人如使用耐藥基因屏障較低的藥物，應(yīng)考慮增加第二種無(wú)交叉耐藥性的藥物，防止病毒耐藥后反彈；如使用耐藥基因屏障較高藥物，應(yīng)當(dāng)繼續(xù)每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次直到48周以后；如使用抗病毒作用較慢的藥物(如：阿德福韋)，應(yīng)當(dāng)繼續(xù)每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次；到治療48周時(shí)，如仍為部分應(yīng)答或不充分應(yīng)答，應(yīng)改變治療藥物，除非HBVDNA接近可檢測(cè)的下限；如在治療48周時(shí)達(dá)到完全應(yīng)答，應(yīng)繼續(xù)治療。不充分應(yīng)答被定義為：在治療24周時(shí)，HBVDNA≥2000IU/ml(≥4log10copies/ml)。第38頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒耐藥的預(yù)防1．使用抗病毒療效理想和有高耐藥基因屏障的藥物。在目前上市的乙肝抗病毒藥物中，干擾素療程短，不引起病毒耐藥；在口服抗病毒藥物中，選擇高耐藥基因屏障的藥物。2．規(guī)范治療和提高病人治療的依從性治療的規(guī)范性和病人的依從性可減少耐藥的發(fā)生，如果不按照要求隨意更換藥物、不按時(shí)服藥或隨意停藥，就會(huì)增加病毒耐藥的機(jī)會(huì)及其他危害（舉例4：略）。第39頁(yè)，課件共43頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.掌握好抗病毒指征及停藥標(biāo)準(zhǔn)指征：轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)反復(fù)增高，HBVDNA陽(yáng)性停藥標(biāo)準(zhǔn):