分子生物學(xué)基因重組和基因工程

分子生物學(xué)基因重組和基因工程第1頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA克隆、測(cè)序與重組技術(shù)的歷史1973年，StanleyCohen等人首次獲得體外重組DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化學(xué)裂解DNA測(cè)序問世不久，Sanger等的雙脫氧測(cè)序法20世紀(jì)90年代啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(humangenomeproject，HGP)重組DNA技術(shù)學(xué)(RecombinantDNATechnology)第2頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第3頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月自然界不同物種或個(gè)體之間的基因重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的，它是基因變異和物種演變、進(jìn)化的基礎(chǔ)?；蜣D(zhuǎn)移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表達(dá)及癌基因激活等過程中起重要作用人類進(jìn)行基因克隆、動(dòng)物克隆以及基因治療等科學(xué)實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐中所進(jìn)行的基因操作也離不開基因轉(zhuǎn)移和重組。重組DNA技術(shù)就是基于人們對(duì)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組的認(rèn)識(shí)發(fā)展起來的。第4頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月基因重組（Genere-arrangement，recombination）是指整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，井能在新的位置上復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。是自然界常見的現(xiàn)象，基因重組有病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，細(xì)胞在增殖、分裂、分化過程也發(fā)生基因重組或重排（rearrangement）基因重組有多種方式。第5頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA重組接合作用

(conjugation)轉(zhuǎn)化作用

(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)

座

(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)第6頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組是最基本的DNA重組方式第7頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月同源重組需要一些重組蛋白和酶。如RecA、B、C、D及DNA連接酶等。同源重組不依賴特異DNA序列，而依賴兩分子之間的相同或相似性。若轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的外源DNA與宿主DNA同源,那么外源DNA就可以整合進(jìn)宿主的染色體。第8頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：

兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：第9頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月片段重組體

（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組

體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

第10頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)第11頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體第12頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′第13頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體②①①②5′3′5′5′5′3′3′3′第14頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二、接合作用（conjugation）當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組方式第15頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒第16頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有的細(xì)菌染色體外有一比較大的質(zhì)粒-F因子(Ffactor)，是一個(gè)小型環(huán)狀雙鏈DNA。F因子中含有性鞭毛蛋白編碼基因，這決定性鞭毛的形成。有F因子的細(xì)菌有性鞭毛。當(dāng)F+和F-的細(xì)菌相互接觸的時(shí)候，它們之間通過鞭毛的連接構(gòu)成通道，F(xiàn)+細(xì)菌中雙連DNA的一條鏈打開一個(gè)缺口，進(jìn)入另一個(gè)細(xì)菌，F(xiàn)+細(xì)菌按滾環(huán)復(fù)制另一條鏈；進(jìn)入F-細(xì)菌的那條連做模板，復(fù)制成兩條鏈，這樣兩個(gè)細(xì)菌都成為F+細(xì)菌。質(zhì)?！?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子第17頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)化作用(transformation)定義：通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化。第18頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型（RH型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌（SH型）。提取致病型肺炎雙球菌的DNA，加入到RH型菌里培養(yǎng)，RH型就會(huì)轉(zhuǎn)化成致病的SH型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：第19頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月四、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。第20頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，其外殼留在細(xì)菌的表面，噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)其生活途徑有兩種：第21頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑

(lysogenicpathway)第22頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1、溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)λDNA在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制，也可以表達(dá)產(chǎn)生噬菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的λ噬菌體，當(dāng)生成大量的λ噬菌體后，細(xì)胞溶解，

噬菌體就釋放出來了。第23頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。第24頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)

λDNA進(jìn)入細(xì)菌后，可以通過基因重組整合到細(xì)菌染色體DNA中，維持下去，隨著細(xì)菌的分裂繁殖，λDNA被擴(kuò)增，當(dāng)在一定條件下，這一段λDNA可以被切下來擴(kuò)增、復(fù)制，進(jìn)入溶菌途徑。如果λDNA切下時(shí)帶有了細(xì)菌的DNA,包裝成噬菌體后，新的噬菌體DNA就帶有細(xì)菌DNA,當(dāng)其再感染另外的一個(gè)細(xì)菌時(shí)，通過溶源途徑，就將原細(xì)菌的DNA，帶給了新的細(xì)菌，這就是轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。第25頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月目錄第26頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月五、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。第27頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合第28頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。第29頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第30頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第31頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC第32頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段第33頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過程第34頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月六、轉(zhuǎn)座(transposition)由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。

第35頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

插入序列(insertionsequences,IS)組成：（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列：

9－41bp,位于兩側(cè)特有的正向重復(fù)序列：4－12bp，位于反向重復(fù)序列外側(cè)，為插入序列所特有。一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因：產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶，引起轉(zhuǎn)座，位于中間長(zhǎng)750－1500bp正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列IRTransposaseGeneIR其組成為：第36頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：1、保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)：2、復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)：從原位遷至新位插入序列復(fù)制后，一個(gè)復(fù)制本遷到新位，另一個(gè)保留在原位。第37頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)座子Transposon末端反向重復(fù)序列TerminalrepeatsTargetDNATransposasemakesstaggeredcutsinthetargetsiteTransposaseGene1、保守性轉(zhuǎn)座錯(cuò)位開切轉(zhuǎn)座子第38頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)座子TransposonThetransposonisinsterdatthesiteofthecutsReplicationfillsinthegapsduplicatingthesequencesflankingThetransposon復(fù)制轉(zhuǎn)座子的旁側(cè)

序列，填補(bǔ)空隙第39頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2?插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座第40頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座第42頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因第43頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L第44頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第45頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第46頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年

美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。1977年

美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年

開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年

英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。第47頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)概念DNA克隆

工具酶

目的基因

基因載體基本原理

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系主要內(nèi)容：第48頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』?cloning):

獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）DNA克隆分子克隆

（DNA克?。┘?xì)胞克隆

個(gè)體克隆

（動(dòng)物或植物）

技術(shù)水平

第49頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)即重組體，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆各種來源的DNA即目的DNA,也叫外源DNA第50頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA技術(shù)/重組DNA工藝學(xué)。第51頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶（基因工程中重要的酶）

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶(PCR技術(shù)中應(yīng)用的一種耐熱的DNA聚合酶，95度不變性)第52頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工

具

酶功

能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第53頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。是細(xì)菌內(nèi)是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶，如果有外來的DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，則RE將其水解掉，對(duì)細(xì)菌自身起保護(hù)作用。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease，RE)第54頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)現(xiàn)1970年，美國(guó)的HamiltonSmith偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌（HaemophilusinfluenzaeRd）能降解外源噬菌體DNA，且該菌的無細(xì)胞的抽提液也具有降解（酶）活性。該酶能降解E.coliDNA，但不降解產(chǎn)生該酶的Haemophilus自身細(xì)胞DNA，稱該酶為HindⅡ，能結(jié)合并識(shí)別的DNA序列為：限制性內(nèi)切酶能夠在DNA上尋找特定的位點(diǎn)切斷雙鏈，被稱為“分子剪刀”。5′-G-T-Py-↓-Pu-A-C-3′3′-C-A-Pu-↑-Py-T-G-5′（Py=嘧啶、Pu=嘌呤）第55頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

特點(diǎn)1）均來自微生物，并據(jù)此而進(jìn)行命名；2）特異識(shí)別連續(xù)的4、6或8個(gè)堿基；按其識(shí)別順序可以計(jì)算切割幾率：假定四種堿基在DNA鏈上隨機(jī)分布，則識(shí)別4、6、8個(gè)堿基順序出現(xiàn)的幾率分別是1/44、1/46、1/48（識(shí)別順序出現(xiàn)的堿基間隔）。識(shí)別序列越長(zhǎng)、切點(diǎn)越少。3）識(shí)別序列多具有回文結(jié)構(gòu)（palindrome）；即識(shí)別序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱?；匚慕Y(jié)構(gòu)多數(shù)不是重要的結(jié)構(gòu)基因。4）其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。第56頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）

與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。回文結(jié)構(gòu)第57頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第58頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月I：切割位點(diǎn)：非特異性，跟識(shí)別位點(diǎn)大于1000bpII:同于或接近于識(shí)別部位III:跟識(shí)別位點(diǎn)3端24-26bp處切割位點(diǎn)：第59頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制修飾系統(tǒng)

(RestrictionandModificationSystem)限制性核酸內(nèi)切酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA第60頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口

：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第61頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，即從到的方向閱讀是完全相同的5′3′

識(shí)別的回文結(jié)構(gòu)為短小序列大多為4-6bp回文結(jié)構(gòu)指的是：二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(180度旋轉(zhuǎn))，即點(diǎn)對(duì)稱注意：線對(duì)稱不是回文結(jié)構(gòu)第62頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第63頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度為4－8個(gè)bp，6個(gè)最多見。不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍末端（compatibleend),可用連接酶連接。粘性末端端突出端突出5′－3′－5′AATTC——3′G——5′G——3′AATTC——第64頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月SATORAREPOTENETOPERAROTAS具有反向重復(fù)序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA第65頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：第66頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第67頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱

識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶第68頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）目的基因(targetgene)

應(yīng)用重組DNA技術(shù)所要分離、獲得的基因。

應(yīng)用重組DNA技術(shù)的目：1、為分離、獲得某種感興趣的基因或DNA序列，即目的基因（targetDNA）或外源DNA。2?為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物—蛋白質(zhì)第69頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA(complementaryDNA)雙稱互補(bǔ)DNA

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

目的基因的類型：DNA克隆時(shí)構(gòu)建的嵌合體DNA組成包括：載體DNA+目的DNA第70頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月獲取目的基因的方法：1、直接從組織或細(xì)胞染色體DNA中分離，限制性酶切；2、利用DNA合成儀化學(xué)法合成，或用PCR法擴(kuò)增；3、提取mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接克隆，或建立c-文庫再從中篩選。4、利用鳥槍法建立G-文庫，再用核酸探針從基因文庫中“釣”取。5、PCR方法第71頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）基因載體

定義能攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的可獨(dú)立復(fù)制的完整的一些DNA分子。又稱克隆載體。其中為表達(dá)出蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的載體又稱表達(dá)載體。

常用載體質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA第72頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。(大量獲得基因片段)表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成

多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。(大量獲得表達(dá)產(chǎn)物)第73頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。第74頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月理想基因載體應(yīng)具備的條件可在宿主細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制（具有自身的復(fù)制子并能攜帶外源性DNA一同擴(kuò)增）；有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）；載體分子應(yīng)盡可能小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制；有兩個(gè)以上的篩選標(biāo)記（抗藥性、酶基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、形成嗜菌斑等）?？截悢?shù)多、與宿主易于分離、抗剪切力強(qiáng)。表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子等。第75頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1－3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選，能加0.1－10kb的基因第76頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月以大腸桿菌中的質(zhì)粒載體為例：大腸桿菌有一套自己的染色體，在染色體之外還有一環(huán)狀DNA拿出來，因?yàn)樗w積小，容易操作，通過人工改造變成載體。載體有幾個(gè)重要部分：1、用來復(fù)制的部分：克隆的話需要復(fù)制，要有調(diào)控的元件2、人工改造的部分，用來篩選轉(zhuǎn)到細(xì)胞是否成功。因?yàn)檫@一段的編碼產(chǎn)物可以對(duì)抗抗菌素對(duì)宿主細(xì)胞的殺傷。如氨芐青霉素抗性基因，根據(jù)需要的不同選擇不同的抗性基因。3、裝上LacZ基因：乳糖操縱子，外界給了乳糖，可變成半乳糖，如果沒有葡萄糖LacZ如果成功轉(zhuǎn)到大腸桿菌，就會(huì)產(chǎn)生在含有X-gal、IPTG的培養(yǎng)基培養(yǎng)，B-半糖苷酶分解X-gal的顯色反應(yīng)很靈敏。B-半糖苷酶可以分解X-gal變成藍(lán)色，如果這個(gè)基因遭到破壞，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色，IPTG半乳糖的類似物，很有效地啟動(dòng)乳糖操縱子的基因轉(zhuǎn)錄。第77頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月人工構(gòu)建質(zhì)粒PBR322全長(zhǎng)4363堿基對(duì)，有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，2個(gè)抗生素的抗性基因（氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因）有多個(gè)單一的酶切位點(diǎn)第78頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第79頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆－目的基因較?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。康幕蜉^在大）噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第80頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)λ噬菌體DNA中間部分進(jìn)行改造，替換原來的結(jié)構(gòu)基因，裝上目的基因，利用它容易感染原核和真核細(xì)胞的性質(zhì)，把目的基因帶進(jìn)去，其容量高，80－20Kb病毒載體用的越來越多，因?yàn)椴《靖腥炯?xì)胞的效率非常高（如，大腸桿菌載體效率不高）而病毒幾乎百分之百。病毒依靠表面的蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞結(jié)合，去感染，把它的內(nèi)容物釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。病毒基因組在兩頭有包裝信號(hào)，中間是病毒的結(jié)構(gòu)基因，第一步改造是把兩頭的結(jié)構(gòu)信號(hào)拿掉，僅把結(jié)構(gòu)基因重組，轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞，能轉(zhuǎn)成功的話，進(jìn)入的全是結(jié)構(gòu)基因與宿主的基因組整合，利用宿主的一切系統(tǒng)，把它的所有基因產(chǎn)物表達(dá)出來，在胞漿呆著，叫包裝細(xì)胞；第二步，包裝信號(hào)與目的基因重組，然后再與載體重組，轉(zhuǎn)染到剛才已經(jīng)建好的包裝細(xì)胞中。包裝信號(hào)是與目的基因連在一起的，利用宿主的基因組不斷復(fù)制更多的帶目的基因和包裝信號(hào)的片段，這些片段當(dāng)它與與已經(jīng)有了的病毒蛋白相遇，包裝信號(hào)發(fā)揮作用，可以包裝成新的病毒（含有目基因但沒有病毒的結(jié)構(gòu)基因了），有感染力但無結(jié)構(gòu)基因了。第81頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

柯斯質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體

（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）3、其他第82頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性質(zhì)粒(cosmid)第83頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

第84頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月如果要獲得一個(gè)DNA克隆，操作：1、從真核生物染色體DNA中獲取目的DNA。2、基因載體的選擇和構(gòu)建，如質(zhì)粒。3、將載體和目的基因用同一種限制性內(nèi)切酶來切割，產(chǎn)生相同的粘性末端。4、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因與載體的并接成重組體）。5、將重組體導(dǎo)入受體細(xì)菌（細(xì)胞）。6、篩選出含有重組體的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，并無性繁殖重組體的目的基因（細(xì)菌擴(kuò)增得到DNA克?。?。7、如果要獲得蛋白質(zhì)，最終還需要表達(dá)。第85頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Host宿主細(xì)胞E.Coli–the“factory”usedinthegeneticengineeringofinsulin第86頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有了基因有了載體，要想最終實(shí)現(xiàn)獲得大量基因或產(chǎn)物，最終都要放到hostcells實(shí)現(xiàn)。最常用的有3類：大腸桿菌、單細(xì)胞的真核生物（酵母B4）真核哺育類細(xì)胞。拿基因根據(jù)目的不同，取的組織或細(xì)胞不同第87頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

以

質(zhì)

粒

為

載

體

的DNA

克

隆

過

程第88頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）目的基因的獲?。只瘜W(xué)合成法（化學(xué)合成儀）

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

；或可推導(dǎo)出序列的基因，如胰島素的基因、干擾素的基因。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)第89頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1?化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。第90頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。簡(jiǎn)稱G－文庫。它表達(dá)了細(xì)胞整套基因。2、從基因組DNA文庫獲取目的基因第91頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月基因文庫：提純生物體全部DNA，用限制性內(nèi)切酶隨機(jī)切割成大致相同的數(shù)以萬計(jì)的片段，重組入同一類載體上，轉(zhuǎn)化宿主菌保存，即得基因文庫。（1）G-文庫：用基因組總DNA制備的基因庫。（2）c-文庫：用細(xì)胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備全套cDNA后建立的基因庫。G-文庫比c-文庫基因數(shù)目多第92頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月就研究一個(gè)基因，而且知道這個(gè)基因組織中是表達(dá)的，表達(dá)量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑電泳，成功的RNA是5.8S18S28S三個(gè)條帶非常清楚，如果5.8S不清楚，湊合用，如果28S18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)要在一個(gè)獨(dú)立的空間，所有東西都獨(dú)立，不能與別的實(shí)驗(yàn)混合。得到的是總RNA，我們需要的是mRNA，mRNA尾巴上有polyA，利用這個(gè)特別純化，去掉tRNA、rRNA，有了mRNA為模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相當(dāng)穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保存下來。有了cDNA，酶、引物、底物通過PCR技術(shù)，大量擴(kuò)增。由于知道想做的這段基因的分子量，如果想知道這段基因的分子量，跑電泳，就可以大概知道拿到的這段基因是不是想要的基因，如果與理論基因分子量是對(duì)應(yīng)的，那就可能是，最終的結(jié)論還需要測(cè)序。如果是想要的基因，與載體重組，重組后轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)到細(xì)胞有三種方法：化學(xué)的、物理的，生物的。物理的方法比較簡(jiǎn)單有基因槍，電轉(zhuǎn)；化學(xué)的方法，比如用Ca2+Cl2處理細(xì)胞，細(xì)胞表面的膜變得疏松，載體容易進(jìn)入。質(zhì)子體感染、病毒感染等都可以轉(zhuǎn)入細(xì)胞是否轉(zhuǎn)進(jìn)去，就開始篩。用抗生素先篩質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)進(jìn)去了，再用藍(lán)白斑篩目的基因是否進(jìn)去（藍(lán)斑沒有進(jìn)去，白斑進(jìn)去了）第93頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月限制酶切位點(diǎn)限制酶消化

除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化

外源DNA與載體DNA混合

連接反應(yīng)

體外包裝

用重組噬菌體感染大腸桿菌

~20KbDNA片段

cosLRcos~20Kb外源DNA片段

基因文庫用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫

第94頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子

cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶

載體

受體菌

復(fù)制3、

從cDNA文庫獲取目的基因

提取細(xì)胞全部的mRNA做模板，通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的全套雙鏈cDNA后,建立的基因文庫。

簡(jiǎn)稱c－文庫。第95頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第96頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細(xì)胞的分子克隆。(polymerasechainreaction)

PCR是根據(jù)DNA復(fù)制的原理，在體外利用酶促反應(yīng)獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)。4、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）第97頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第98頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第99頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR是根據(jù)復(fù)制的原理，在體外利用酶促反應(yīng)獲得特異序列的基因組DNA或者cDNA的專門技術(shù)。

PCR的反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、DNA聚合酶、dNT及含有Mg2+的沖液（激活劑）。第100頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1、變性：將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至95℃，使模板DNA完全變性解開成單鏈；2、退火（復(fù)性）：將溫度降至適宜（50℃左右），使引物與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合；3、延伸：將溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底

物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過25－30次循環(huán)后，指數(shù)增長(zhǎng)可將模板DNA擴(kuò)增達(dá)百萬倍。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理

第101頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR反應(yīng)條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第102頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建－選根據(jù)目的基因的性質(zhì)、含有哪種核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、目的基因片段的大小等選擇適當(dāng)?shù)目寺≥d體，目前克隆載體已商品化，購買即可。目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。第103頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細(xì)菌黏粒~50kb細(xì)菌BAC~400kb細(xì)菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞第104頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）外源基因與載體的連接－

接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（連接成重組體）第105頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端連接

GGATCCCCTAGG

GGATCCCCTAGG

G

GATCCCCTAG

G

G

GATCCCCTAG

G

GGATCCCCTAGGDNA連接酶

目的基因DNA和載體DNA都含有同一個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切點(diǎn)，用同一種酶來切割，產(chǎn)生相同的粘性末端（配伍末端）。第106頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用

BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接第107頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。第108頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月平端連接

適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端不是配伍的粘端經(jīng)特殊酶的處理（補(bǔ)齊或切平）變?yōu)槠蕉?。如末端核酸轉(zhuǎn)移酶將其補(bǔ)齊或用核酸內(nèi)切酶將突出的一端其水解掉，切平變?yōu)槠蕉?。?09頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因

自連第110頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月同聚物加尾連接由末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。如將兩條鏈的一條鏈接上TTTT,另一條鏈的末端都接上AAAA，TTTT和AAAA就成了互補(bǔ)的末端，就可以連接。第111頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′第112頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

人工接頭(linker)連接人工接頭是一段含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的寡核苷酸。將平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷酸鏈（即加上人工接頭），再用限制性內(nèi)切酶來切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。也就是將載體和目的基因都加上人工接頭，或者是目的基因已經(jīng)有了一個(gè)限制性內(nèi)切酶的粘性末端，可以在載體上加一人工接頭，產(chǎn)生相同的粘性末端。第113頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第114頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月受體菌條件：安全宿主菌（人工處理不致病的大腸桿菌）

限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

容易接受重組DNA）

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌－轉(zhuǎn)第115頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定－篩重組DNA導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過培養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來，這一過程即為篩選（screening)或選擇（selecting)。第116頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

(1)利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達(dá)特性篩選(3)利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選

篩第117頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸雜交法(4)DNA測(cè)序法

3.親和篩選法第118頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等重組體的篩選方法有：第119頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。其特點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型。

(1)抗藥性標(biāo)記選擇

(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交

Southern印跡1、直接選擇法第120頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）、抗藥性標(biāo)記法（插入失活法）將目的基因插入帶芐青霉素抗性基因（amp）和四環(huán)素抗性基因（tet）的載體中的tet基因中（兩個(gè)抗性基因之一中），則被插入的tet基因失活。在分別含有氨芐青霉素和含有四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再進(jìn)行篩選。如果基因不失活，比如氨芐青霉素基因不失活，那么在氨芐青霉素存在的情況下培養(yǎng)能生長(zhǎng)，可以抵抗抗生素（氨芐青霉素）；如果這個(gè)基因失活了，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中就不能抵抗四環(huán)素，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中就不能生長(zhǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)情況來篩選。第121頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月(插入失活法)

抗藥性標(biāo)記選擇第122頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月如質(zhì)粒pBR322,含有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗性基因，將目的基因插入到四環(huán)素抗性基因的位置，如果重組成功了，插入后轉(zhuǎn)入受體菌進(jìn)行培養(yǎng)，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)（氨芐青霉素基因正常）；在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，可判斷重組體重組成功，如果沒重組成功，它在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都生長(zhǎng)，以此來判斷哪個(gè)是重組體，哪個(gè)不是重組體。第123頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）、標(biāo)志補(bǔ)救（markerrescue）若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，就可利用對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的依賴表型來篩選。如α互補(bǔ)的原理：第124頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18X-gal

:半乳糖苷酶的底物IPTG:乳糖操縱子的強(qiáng)誘導(dǎo)劑第125頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體構(gòu)建的質(zhì)粒PUC1819，含有l(wèi)acZ基因，編碼的蛋白質(zhì)是B-半乳糖苷酶，但它是N端的部分序列。要轉(zhuǎn)入的大腸桿菌的染色體中含有B-半乳糖苷酶的C端編碼序列，只有這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)到細(xì)菌后，質(zhì)鑿的基因和大腸桿菌的基因同時(shí)表達(dá)，然后兩個(gè)結(jié)合在一起，細(xì)菌才有B-半乳糖苷酶活性，有了B-半乳糖苷酶活性才可以水解乳糖，水解乳糖后產(chǎn)生藍(lán)色的菌落。這個(gè)細(xì)菌就是營(yíng)養(yǎng)缺陷性的，它缺陷B-半乳糖苷酶的N端序列，質(zhì)粒補(bǔ)充了它的B-半乳糖苷酶基因的活性。

LacZ基因附近有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在這個(gè)位點(diǎn)可以插入外源DNA,如果插入了外源DNA就破壞了N端編碼序列，破壞之后再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌內(nèi)它就不能夠編碼B-半乳糖苷酶的N端，就不能補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷，這個(gè)細(xì)菌就沒有B-半乳糖苷酶的活性，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)就是白色的菌落。藍(lán)色菌落表示外源DNA沒有插入進(jìn)來，如果插進(jìn)來就是白色菌落。我們需要的是白色菌落，是含有重組體的細(xì)菌。將它拿出來后再擴(kuò)增。（P359頁圖14－13）上圖解釋：第126頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

加入的X－gal是B-半乳糖苷酶的底物，IPTG是實(shí)驗(yàn)室常用的乳糖操縱子的強(qiáng)誘導(dǎo)劑（比半乳糖的作用要強(qiáng)），誘導(dǎo)后乳糖操縱子才能表達(dá)。第127頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄第128頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）、分子雜交法：利用P標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的轉(zhuǎn)化子DNA或克隆的DNA片段進(jìn)行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。有兩種方法：原位雜交Southern印跡一般篩選需要幾種方法聯(lián)合使用。32第129頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

原位雜交第130頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

Southern印跡第131頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非直接選擇法：

免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選。包括：免疫化學(xué)方法酶免檢測(cè)分析因?yàn)榇朔椒ú恢苯予b定基因，是鑒定的基因表達(dá)產(chǎn)物所以稱非直接選擇法。第132頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法

第133頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)體系的建立：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)（產(chǎn)生蛋白質(zhì)）表達(dá)體系分：原核表達(dá)體系：

(E.coli表達(dá)體系最為常用)

真核表達(dá)體系：

（如：酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞）第134頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)

E.coli表達(dá)體系的不足：缺乏轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的加工機(jī)制不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體

(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1.原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用)第135頁，課件共159